平成16年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業
研究成果報告書概要


研究推進分野名   発生・分化・再生
研究プロジェクト名 肝膵胆管形成と疾患制御に関する研究
(英文名) Studies on the Organogenesis and Disease Control in the Hepatobiliary and Panreatic System
研究期間 平成12年度 〜 平成16年度

プロジェクトリーダー 研究経費 総額 368,265千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名
遠藤 文夫・熊本大学
大学院医学薬学研究部・教授
内訳 平成12年度 76,265千円
平成13年度 52,000千円
平成14年度 72,000千円
平成15年度 86,000千円
平成16年度 82,000千円
  1. 研究組織(コアメンバー及び研究協力者)
  2. 氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
    横内 裕二 熊本大学・発生医学研究センター・教授 肝臓幹細胞とそれによる肝・胆管形成機構の解析(肝発生)
    永渕 昭良 熊本大学・発生医学研究センター・教授 肝臓細胞再構築による肝疾患の克服(肝再構築)(平成13年4月1日〜平成14年3月31日)
    粂  昭苑 熊本大学・発生医学研究センター・教授 ES細胞から肝・膵細胞の作成 (平成15年4月1日から)
    湯本 英二 熊本大学・大学院医学薬学研究部・教授 唾液腺組織の検討(平成15年9月1日から)
    篠原 正徳 熊本大学・大学院医学薬学研究部・教授 唾液腺組織の検討(平成16年4月1日から)
    中村 公俊 熊本大学・医学部附属病院・助手 動物実験を中心とした研究 (平成13年4月1日から)
    大里 義治 熊本大学・発生医学研究センター・リサーチ・アソシエイト 肝臓幹細胞とそれによる肝・胆管形成機構の解析(肝発生)(平成12年8月16日〜平成14年3月31日まで)
    永野 幸治 熊本大学・発生医学研究センター・リサーチ・アソシエイト 動物実験を中心とした研究 (平成14年4月1日〜平成15年1月31日)
  3. 研究計画の概要(簡潔に記入)
    1. 肝細胞死を特徴とする遺伝的肝疾患モデルマウスにおける遺伝子改変肝細胞の細胞移植を行い、それによって肝臓を補正された細胞で置換する技術を確立する。同時に肝疾患モデルにおいて移植可能な肝細胞分画を明らかにし、これらの細胞生物学的性格を明らかにする。これらの性質を元に、成体に存在する肝臓前駆細胞の分離方法を確立する。この成果をもとに肝形成幹細胞の試験管内・生体内での増殖・分化能を検討する。ラット、マウス成体および胎児から得られた幹細胞の移植を行う。このとき肝細胞増殖・分化の至適な外的条件を検討する。


    2. 全能性幹細胞から誘導された肝・膵臓細胞の分離をおこなう。そのための表面マーカーの検索を行う。また肝臓膵臓細胞の産生に必要な培養条件などの検討を行う。


    3. 消化管から肝胆膵の発生に至る形態形成に関与する遺伝子を同定する消化管から肝胆膵の発生に至る形態形成に関与する遺伝子の同定を進める。候補遺伝子の解析を行うとともに、発生時期の遺伝子発現パターンについて検討する。
  4. 研究目的(研究プロジェクトが当初目指した開発、立証、解析、確立等の目的を箇条書きで簡潔に記入)
  5. 倫理的、経済的に制約の大きい現在のヒト間での臓器移植に代わる、21世紀の移植医療創出をめざし、各種臓器を人為的に形成再生する基本技術を開発する。内胚葉系臓器である肝膵胆管系は消化管から発生し、それらの分化決定には様々な転写制御因子、そして増殖分化の制御には既知あるいは未知の分泌性因子が関わっている。本研究プロジェクトでは、これらの因子を同定し肝膵胆管系形成の分子メカニズムを明らかにする。この肝臓の発生および組織形成気候を解析する研究と連動させて、肝前駆細胞移植による肝再構築を試みる。これにより、肝のみならず胆管・膵臓疾患の克服への基盤技術の開発をめざす。
  6. 研究成果の概要
  7. 4−1 研究計画、目的に対する成果(なお、研究目的が達成できなかったテーマについては、その理由及び今後の展開を記入)
    1. 肝細胞死を特徴とする遺伝的肝疾患モデルマウスにおける遺伝子改変肝細胞の細胞移植においては、この方法を利用して新規の内胚葉系幹細胞を同定する子ができた。またマウスモデルにおいて肝臓を補正された細胞で置換する技術を確立した。これらの研究成果にたって、成体に存在する肝臓前駆細胞の分離方法を確立する。この成果をもとに肝臓膵臓の幹細胞を分離する技術を確立した。さらに試験管内・生体内で肝臓細胞、膵臓細胞を産生する技術を確立した。


    2. 全能性幹細胞から誘導された肝・膵臓細胞の分離をおこなう方法を確立した。この方法ではGFP標識された細胞が膵臓の前駆細胞として認識される。この方法で分離した前駆細胞の遺伝子発現を網羅的に調べ、転写調節因子の検討を行い、新知見を得た。


    3. ニワトリを用いて消化管から肝胆膵の発生に至る形態形成に関与する遺伝子を同定する研究では新たに4種の遺伝子を同定した。これによって、肝臓発生の早期の空間的時間的遺伝子発現パターンについて新しい知見を得た。


    4. これらの成果によって当初計画した成果はほぼ達成し、目的についても基盤技術の確立は十分に達成できたといえる。
    4−2 研究計画、目的外の成果(経緯、状況、展望等を記入)
    1. 成体に存在する内胚葉幹細胞システムの理解とそのシステムを利用した新しい幹細胞の分離方法を確立した。このシステムには幹細胞のほか幹細胞の生存増殖を助ける支持細胞の存在が必要であることを見出し、その支持細胞の分離に大きな努力を傾けた。その結果、唾液腺から支持細胞をクローン化した。この支持細胞が産生する液性因子はきわめて幼弱な段階の内胚葉幹細胞を刺激し、生存、増殖させる。この支持細胞の発見は今後の再生医療の展開にきわめて重要と考える。


    2. この研究で分離した未分化幹細胞はクローン動物を作成するドナー細胞として極めて優れていることが判明した。この細胞を利用したクローンブタのコロニーが作成され、医療応用のブタの作成の研究が進められている。
    4−3 研究成果の展望(学問的・学術的なインパクト、新分野の可能性等の今後の展望を具体的に記入)
     本研究において遠藤は唾液腺に内胚葉系多分化能細胞が存在することを見出し、その分離方法の確立と細胞の解析を進め、セルソーターを用いた幹細胞分離方法を確立した。この方法はげっ歯類およびブタ、ヒトにおいて内胚葉系多分化能細胞を分離同定することを可能にした。さらに研究をすすめ、それまでに同定した内胚葉系多分化能細胞よりもさらに未熟と考えられる細胞を同定した。この新しい未熟多分化能細胞は浮遊状態で培養維持することが可能でVLA6陰性、細胞ラミニン陰性の状態のまま長期間培養維持できる。この細胞外マトリックスを反応することで細胞はVLA陽性、細胞内ラミニン陽性細胞へ成熟する。またこの過程には未熟細胞の生存を支持する別の種類の細胞が必要であり、この支持細胞のクローン化もおこなった。これらの研究から成体に存在する内胚葉系幹細胞の存在様式、増殖と分化についての新知見を蓄積することが出来た。それによって肝胆膵疾患の制御を目指す再生医学研究を大きく進展させたと考えている。今後は、ここで示した新規の方法と細胞を用いた再生医療研究が進むだけでなく、試験管内で作成した様々な細胞を用いた毒性試験、創薬研究など多方面での応用が広がると期待される。
      粂らはマウス胚性幹細胞(ES細胞)というモデル系を用いて内胚葉系器官である膵臓への発生分化を試験管内で再現させる実験系を構築した。この試験管内分化誘導系を用いて、ES細胞から内胚葉幹細胞が分化誘導されてくる過程、また、内胚葉から特異的な器官が分化してくる過程の発生現象を解明した。その結果、ES細胞から内胚葉幹細胞への効率のよい分化誘導系を構築した。将来、この方法はヒト細胞への応用も可能であり、直接ヒトの再生医学へ貢献する可能性がある。
      横内らはこのニワトリ胚の肝臓発生段階表の作成、分化マーカーの同定、胚葉特異的遺伝子導入法の開発、器官培養法の開発を行ない、それらを確立した。この系を用いることで、マウス胚よりも圧倒的に短時間、低コストで肝臓発生関連遺伝子の機能を証明できるようになった。一方、肝臓発生に関与する遺伝子群を同定するために、発生関連遺伝子群の中規模発現パターンスクリーニングを行い、肝臓発生期に興味深い発現パターンを示す16種類の遺伝子群を同定した。その内訳は、肝内胚葉特異的遺伝子3個、横中隔間充織特異的遺伝子9個、血管内皮細胞層特異的遺伝子4個であった。近い将来これらの遺伝子の詳細が判明し、肝発生のメカニズムの理解に新しい視点をもたらしてくれるものと期待できる。
    4−4 本事業の趣旨に鑑み、果たした役割(未来開拓につながるどのような成果が得られたのか、具体的に記入)
    1. 新規の研究シーズを多数開発した。これらの研究成果は特許申請という形になり熊本大学をとおして審査を受けているところである。わが国の知的財産を確立することに貢献している。


    2. 内胚葉系細胞へのアプローチ方法を具体的に示し、今後の指針となる研究成果が上がった。これまで技術的な手がかりがなかった分野であったがこの細胞を他の研究室へも配布し、利用してもらうことで内胚葉幹細胞の採取、分離などの技術がひろがりつつある。今後創薬、毒性研究の分野での利用はすすむことから産業分野においてもこの研究の成果が期待できる。


    3. 発生・再生医学の分野で多くの若い研究者の育成を達成できた。この研究に参加した若い研究者は発生および幹細胞生物学の専門家としての知識、技術および倫理観を身につけることが出来たと考える。今後、わが国においてES細胞などを利用した再生医学が進展していく状況を俯瞰すると、このような若い研究者が将来わが国の生命科学分野で大きく貢献することは大いに期待できる。


    4. クローンブタの作成など、異分野の研究の進展に直接関与し影響を与えている。当初計画した成果以上の成果は、異分野における新しい産業の作出など、多方面の良い効果が期待できる。
  8. キーワード
  9. 1.再生医学  2.  幹細胞  3.肝臓
    4.膵臓5.  発生6. 糖尿病
    7.細胞移植8.  遺伝子9. ES細胞
  10. 研究成果発表状況
  11. A.学術雑誌論文(Journal Papers)[査読つきの論文に限ること。]

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Sun M., Hattori S., Kubo S., Awata H., Matsuda I., Endo F A Mouse model of renal tubular injury of tyrosinemia type 1: Development of de toni fanconi syndrome and apoptosis of renal tubular cells in Fah/Hpd double mutant mice.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    J. Am. Soc. Nephrol. 11   291-300 2000

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Ishibashi F., Nunoi H., Endo F., Matsuda I., Kanegasaki S. Statical and mutational analysis of chronic granulomatous disease in Japan with special reference to gp91-phox and p22-phox dificiency.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Human Genetics 106   473-481 2000

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Miura Y., Sek M., Awaya Y., Nihei K., Endo F., Matsuda I., Indo Y. Mutation and polynorphism analysis of the TRKA (NTRK1) gene encoding a high-affinity receptor for nerve growth factor in congenital insensitivity to pain with anhidrosis (CIPA) families.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Human Genetics 106   116-124 2000

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Sperandeo M.P., Bassi M.T., Roboni M., Parenti G., Buoninconti A., Manzoni M., Incerti B., Larocca M.R., Racco M.D., Strisciuglio P., Dianzani I., Parini R., Candito M., Endo F., Ballabio A., Andria G., Sebastio G., Borsani G Structure of the SLC7A7 Gene and Mutational Analysis of Patients Affected by Lysinuric Protein Intolerance.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Am J. Hum. Genet. 66   92-99 2000

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Tomoeda K., Awata H., Matsuura T., Matsuda I., Ploechl E., Milovac T., Boneh A, Scott C. R., Danks D. M. and Endo F. Mutations in the 4-Hydroxyphenylpyruvic Acid Dioxygenase Gene Are Responsible for Tyrosinemia Type Ⅲ and Hawkinsinuria.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Molecular Genetics and Metabolism 71   506-510 2000

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Ishibashi F., Mizukami T., KanegasakiS., Motoda L., Kakinuma R., Endo F., Nunoi H. Improved superoxide-generating ability by interferong due to splicing pattern change of transcripts neutrophils from patients with a splice site mutation in CYBB gene.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Blood 98   436-441 2001

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Nakazato H., Hattori S., Karashima S., Kawano T., Seguchi S., Kanahori M., Endo F.: Another autosomal recessive form of focal glomerulosclerosis with neurological findings.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Pediatr Nephrol. 16   16-19 2002

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Matsubasa T., Uchino T., Karashima S., Tanimura M., Endo F. Oxidative stress in very low birth weight infants as measured by urinary 8-OhdG.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Free Radical Res. 36   189-193 2002

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Kuhara T., Ohse M., Inoue Y., Yorifuji T., Sakura N., Mitsubuchi H., Endo F., Ishimatu J. Gas chromatographic-mass spectrometric newborn screening for propionic acidaemia by targeting methylsitrate in dried filter-paper urine sampoes.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    . Inherit. Metab. Dis. 25   98-106 2002

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Endo F., Sun M-S. Tyrosinaemia type I and apoptosis of hepatocytes and renal tubular cells.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    J. Inheril. Metab. Dis 25   227-234 2002

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Yorifuji T., Kawai M., Muroi J., Mamada M., Kurokawa K., Shigematsu Y., Hirano S., Sakura N., Yoshida I., Kuhara T., Endo F., Mitsubuchi H., Nakahata T Unexpectedly high prevalence of the mild form of propionic acidemia in Japan: presence of a common mutation and possible clinical implications.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Hum. Genet. 111   161-165 2002

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Saneyoshi, T., Kume, S*., Amasaki, Y., and Mikoshiba, K. The Wnt/calcium pathway activates NF-AT and promotes ventral cell fate in Xenopus embryos.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Nature 417   295-299 2002

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Natsume, T., Taoka, M., Manki, H., Kume, S., Isobe, T. and Mikoshiba, K. Rapid analysis of protein interactions: On-chip micropurification of recombinant protein expressed in Esherichia coli.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Proteomics 2   1247-1253 2002

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Endo F., Tanaka Y., Tomoeda K., Tanoue A., Tsujimoto G., Nakamura K. Animal model reveal pathophysiologies of tyrosinemias.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    The Journal of Nutrition. 133   2063S-2067S 2003

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Okumura K., Nakamura K., Hisatomi Y., Nagano K., Tanaka Y., Terada K., Sugiyama T., Umeyama K., Matsumoto K., Yamamoto T., Endo F. Salivary gland progenitor cells induced by duct ligation differentiate into hepatic and pancreatic lineages.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Hepatology 38   105-113 2003

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Nakamura K., Mitsubuchi H., Miyayama H., Yatsunami K., Ishimatsu J., Yamamoto T., Endo F. Complete absence of bile and pancreatic ducts in a newborn: a new entity of congenital anomaly in hepato-pancreatic development.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    J Human Genetics 48   380-384 2003

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Kuribayashi I., Kuge H., Santa J. R., Mutlaq Z. A., Yamasaki N., Furuno T., Takahashi A., Chida S., Nakamura T., Endo F., Doi Y., Onishi S., Shizuta Y. A missense mutation (GGC[435Gly→AGC[Ser]] in exon 8 of the CYP11B2 gene inherited in Japanese Patients with Congenital hypoaldosteronism.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Horm. Res 60   255-260 2003

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Horinouchi I., Nakazato H., Kawano T., Iyama K., Furuse A., Arizono K., Machida J., Sakamoto T., Endo F., Hattori S. In situ evaluation of podocin in normal and glomerular diseases.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Kidney Int 64   2092-2099 2003

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Rajagopal, J., Anderson, W. J., Kume, S., Martinez, O. I. and Melton, D.A. Insulin staining of ES cell progeny from insulin uptake
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Science 299   363 2003

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Saneyoshi, T., Kume, S. and Mikoshiba, K. Xenopus calcium/calmodulin-dependent protein kinase I in Xenopus laevis: Identification and characterization of a novel isoform of CaM-KI
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 134   499-507 2003

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Hisatomi Y., Okumura K., Nakamura K., Matsumoto S., Satoh A., Nagano K., Yamamoto T., Endo F. Flow cytometric lsolation of endodermal progenitors from mouse salivary gland differentiate into hepatic and pancreatic lineages.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Hepatology 39   667-675 2004

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Adachi N., Hirota M., Hamaguchi M., Okamoto K., Watanabe K., Endo F. Serum cytocheome C level as a prognostic indicator in patients with systemic inflammatory response syndrome.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Clinica Chimica Acta 342   127-136 2004

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Kawabe J., Kimura H., Ito Y., Ando Y., Tanaka-Kitajima N., Hayakawa M., Nunoi H., Endo F., Motishima T. Evaluation of systemic inflammatory responses in neonates with herpes simplex virus infection.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    J. Infectious Dis. 190   494-498 2004

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Endo F., Matsuura T., Yanagita K., Matsuda I. Clinical manifestations of inborn errors of the urea cycle and related metaboli c disorders furing childhood.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Am. Soc. Nutr. Sci.     1605S-1609S 2004

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Kodama, K., Toyonaga, T., Kondo, T., Matsumoto, K., Tsuruzoe, K., Kawashima, J., Goto, H., Kume, K., Kume, S., Sakakida, M. and Araki, E. Enhanced expression of PDX-1 and Ngn3 by exendin-4 during  cell regeneration in STZ-treated mice.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Biochem. Biophys. Res. Comm. 327   1170-1178 205

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Masaaki Yanai, Norifumi Tatsumi, Fumio Endo and Yuji Yokouchi Analysis of gene expression patterns in the developing chick liver.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Developmental Dynamics     in press 2005

    全著者名 論文名(招待論文にはInvitedを明記)
    Shiraki N., Lai C-J., Hishikari Y. and Kume S. TGF-β signaling potentiates differentiation of embryonic stem cells to Pdx-1 expressing endodermal cells.
    学術雑誌名 初めの頁-終わりの頁 発行年(西暦)
    Genes Cells     in press  


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