平成１６年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業
研究成果報告書概要

研究推進分野名   発生・分化・再生
研究プロジェクト名 分化プログラム制御による組織の再生と構築に関する研究
（英文名） Tissue Regeneration and Construction by Control of Differentiation Programs
研究期間 平成１２年度　〜　平成１６年度

プロジェクトリーダー 研究経費 総額　　４８２，０００千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名		 中辻　憲夫・京都大学
再生医科学研究所・教授		 内訳 平成１２年度　　８６，０００千円
平成１３年度　　８６，０００千円
平成１４年度　１１６，０００千円
平成１５年度　１０３，０００千円
平成１６年度　　９１，０００千円
  1. 研究組織（コアメンバー及び研究協力者）
    2. 氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
    笹井　芳樹 京都大学・再生医科学研究所・教授 ES細胞の分化誘導研究 （平成15年6月30日まで）
    斉藤　哲一郎 京都大学・再生医科学研究所・助教授 神経幹細胞の分化制御機構の研究
    小阪　美津子 京都大学・再生医科学研究所・客員助教授 分化転換機構の研究
    多田　高 京都大学・再生医科学研究所・助教授 再プログラム化機構の研究

    瀬原（藤沢）淳子

    		 京都大学・再生医科学研究所・教授 細胞分化制御機構の研究
    永田　和宏 京都大学・再生医科学研究所・教授 組織分化機構の研究 （平成15年3月31日まで）
    宿南　知佐 京都大学・再生医科学研究所・助教授 細胞分化制御機構の研究
    末盛　博文 京都大学・再生医科学研究所・助教授 ES細胞の特性解析研究 （平成15年4月1日から）
    山下　潤 京都大学・再生医科学研究所・助教授 ES細胞の分化誘導研究 （平成16年4月1日から）
  2. 研究計画の概要（簡潔に記入）
    3. 　再生医学の基盤研究を推進するために、幹細胞の制御と生体組織の構築に関して、次の２項目の研究計画をプロジェクト開始時点で設定した。（１）多能性幹細胞の特性研究と有用細胞への分化誘導、および脱分化と分化転換。（２）細胞外シグナルと生体マトリクスによる組織分化と構築。
    　具体的には、カニクイザル胚性幹細胞（ES細胞）株の特性解析を行ない、未分化状態の維持と各種細胞系譜への分化プログラム制御について研究し、神経系細胞などへの分化制御を目指す。そして幹細胞からの分化誘導、脱分化と分化転換、細胞核の再プログラミングなどの機構と制御について研究する。さらに、細胞外シグナルやマトリクス分子による細胞分化の制御機構の研究を進めることによって、組織再生の技術基盤を確立することを目的とした。
    　 これらの研究を進める中で、平成１３年度開催の推進委員会の助言により、前者の項目すなわちサルES細胞株の培養・操作と分化制御、並びに脱分化・分化転換の研究について、その重要性が特に高いことから、平成１４年度以降はこれら幹細胞と分化制御に関する研究に焦点を絞り込んだ研究を推進した。
  3. 研究目的（研究プロジェクトが当初目指した開発、立証、解析、確立等の目的を箇条書きで簡潔に記入）
    4. 　現在行なわれている臓器移植などの先端医療にはドナー不足と拒絶反応など問題点と限界が存在する。当研究プロジェクトはこれらを解決する次世代医療である再生医学の発展を目指した基盤研究である。すなわち、再生医科学研究所で進められている次の研究項目の展開を目的とした。
    　 （１） 霊長類ES細胞株の樹立と特性解析、培養操作技術の開発
    　 （２） 幹細胞からの分化制御機構の解明
    　 （３） 脱分化や分化転換など細胞の再プログラム化機構の研究
    　 （４） 組織構築制御機構に関する研究
    　 これらの研究テーマについて、分化プログラム制御による組織再生制御という目的意識によって統合することによって、幹細胞を活用した画期的な再生医療を実現させることを目標とした。なお、最後の研究項目（４）については、研究内容を絞り込むために平成１３年度末で終了した。
  4. 研究成果の概要
    5. ４−１　研究計画、目的に対する成果（なお、研究目的が達成できなかったテーマについては、その理由及び今後の展開を記入）
    1. カニクイザルES細胞株の樹立と特性解析：世界的にも少数のみ樹立されているが、前臨床研究などにとって重要なサルES細胞株を複数樹立して特性解析を行うとともに、これらの細胞株を全国の研究者へ供給することに成功した。　 　
    2. 霊長類ES細胞の培養条件の改良：マウスES細胞と比べて困難な点が多い霊長類ES細胞の無血清培養液や継代方法、フィーダー細胞などの培養条件を改良して、安定して未分化性を維持しながら長期増殖を可能にした。 　
    3. 霊長類ES細胞に対する遺伝子導入法の確立：障害に対する感受性の高い霊長類ES細胞に対して、汎用性の高いエレクトロポレーション法による遺伝子導入と薬剤選別方法を確立して、再現性良く外来遺伝子を組み込んだES細胞株の作出を可能にした。 　
    4. 霊長類ES細胞の凍結保存法の改良：従来の凍結保存方法では解離後の生存率が極めて低かったが、急速凍結法（ガラス化法）の条件を検討して簡便に再現性良く生存率を高めることに成功した。 　
    5. 霊長類ES細胞のLIF/STAT3シグナル伝達経路など未分化性維持機構の解析：霊長類ES細胞の未分化性維持に働く分子シグナル機構がマウスES細胞とは大きく異なることを実証した。世界的に開発競争が始まっているヒトES細胞のフィーダー細胞なしの増殖維持を可能にするため、フィーダー細胞由来因子の探索を進めるとともに、少なくとも一定期間はフィーダー細胞なしで未分化性を維持することが可能になった。 　
    6. ES細胞との融合による体細胞核再プログラム化機構の解析：再プログラム化される体細胞核を解析することにより、解きほぐされゲノム全体が緩いクロマチンからなることが明らかになった。未分化細胞特異的遺伝子の発現により、部分的なクロマチン修飾を受けることにより未分化細胞に特異的なエピジェネティクスを確立すると考えられる。 　
    7. サルES細胞を用いた細胞治療の前臨床研究：カニクイザルES細胞から分化誘導したドーパミン産生神経細胞をパーキンソン病カニクイザルの脳内へ移植して治療効果を検証する前臨床研究が京大脳外科グループとの共同研究として行われ、症状を改善することに成功し、世界をリードする研究成果として世界的に注目された。
    ４−２　研究計画、目的外の成果（経緯、状況、展望等を記入）
    　ヒトES細胞の医学利用への期待が大きいが、当研究プロジェクトは、その基盤となる基礎研究から応用研究への発展を実現するために大きく貢献している。特に霊長類ES細胞株の培養維持方法の改良と遺伝子改変などの操作技術の確立（論文１−３参照）は、ヒトES細胞の医学研究への活用や細胞治療の実現を目指す研究に加えて、新薬の毒性試験や創薬探索研究への利用にも不可欠である。当研究プロジェクトと並行して、再生医科学研究所は国内唯一の樹立機関としてヒトES細胞株の樹立と特性解析ならびに国内使用機関への細胞分配を開始しており、培養方法の研修を行うなど全国のヒトES細胞を用いた医学研究を速やかに進展させるための基盤を整備する上で、当研究プロジェクトは極めて重要な役割を果たした。
    ４−３　研究成果の展望（学問的・学術的なインパクト、新分野の可能性等の今後の展望を具体的に記入）
    　ヒトES細胞による再生医療を実現するための基盤となる、霊長類ES細胞の培養方法、凍結保存方法、遺伝子導入方法などを改良して、安定した増殖維持と実験操作を可能にした。未分化性維持の分子機構がマウスES細胞と大きく異なることを明らかにすると共に、フィーダー細胞なしの培養を一定期間可能にするなど、今後の医療応用の基盤を固めた。また、ES細胞との細胞融合による体細胞核の再プログラム化機構の解析によって、将来期待される免疫拒絶を克服した個人対応型幹細胞作出の夢に繋がる研究成果が得られた。さらには、近い将来実現すると考えられるES細胞を用いた細胞治療の臨床試験の基礎となる、サルES細胞を用いた疾患モデルサルへの移植実験を行い、良好な治療成績を得ることに成功した。
    ４−４　本事業の趣旨に鑑み、果たした役割（未来開拓につながるどのような成果が得られたのか、具体的に記入）
    　ヒトES細胞を用いた各種機能細胞への分化誘導、体細胞核移植クローン胚からのES細胞株の樹立、フィーダー細胞なしの培養技術開発などヒトES細胞関連の研究は世界的に益々急速な進展を見せている。ES細胞を用いた細胞移植治療実現のためには霊長類モデルを用いた前臨床試験が不可欠であり、このような研究に使用するために適したサルES細胞の基盤研究と全国研究者への細胞供給を実現した当該プロジェクトは世界的に重要な意義をもつ。さらに、京都大学再生医科学研究所において日本国内で始めて樹立されたヒトES細胞株については、特性解析と分配体制確立を完了して、全国の使用機関への細胞分配を開始しており、当該プロジェクトはその基盤作りに貢献した。
  5. キーワード
    6. １．ES細胞   ２．幹細胞   ３．再生医学
    ４．細胞分化 ５．細胞培養 ６．胚性幹細胞
    ７． ８． ９．
  6. 研究成果発表状況

    7. A.学術雑誌論文（Journal Papers）[査読つきの論文に限ること。]

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Chuma, S. and Nakatsuji, N. Autonomous transition into meiosis of mouse fetal germ cells in vitro and its inhibition by gp130-mediated signaling.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Devel. Biol. 229 2 468-479 2001

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Suemori, H., Tada, T., Torii, R., Hosoi, Y., Kobayashi, K., Imahie, H., Kondo, Y., Iritani, A. and Nakatsuji, N. Establishment of embryonic stem cell lines from cynomolgus monkey blastocysts produced by ivF or ICSI.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Dev. Dynamics 222 2 273-279 2001

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Tada, M., Takahama, Y., Abe, K., Nakatsuji, N. and Tada, T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Curr. Biol. 11 19 1553-1558 2001

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Saito, T. and Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Dev. Biol. 240 1 237-246 2001

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Kawasaki, H., Suemori, H., Mizuseki, K., Watanabe, K., Urano, F., Ichinose, H., Haruta, M., Takahashi, M., Yoshikawa, K., Nishikawa, S.-I., Nakatsuji, N. and Sasai, Y. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99 3 1580-1585 2002

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Hasegawa, K. and Nakatsuji, N. Insulators prevent transcriptional interference between two promoters in a double gene construct for transgenesis.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    FEBS Lett. 520 1-3 47-52 2002

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Asano, T., Hanazono, Y., Ueda, Y., Muramatsu, S., Kume, A., Suemori, H., Suzuki, Y., Kondo, Y., Harii, K., Hasegawa, M., Nakatsuji, N., and Ozawa, K. Highly efficient gene transfer into primate embryonic stem cells with a simian lentivirus vector.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Mol. Therapy 6 2 162-168 2002

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Kimura, H., Tada, M., Hatano, S., Yamazaki, M., Nakatsuji, N. and Tada, T. Chromatin reprogramming of male somatic cell-derived Xist and Tsix in ES hybrid cells. Cytogenet.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Genome Res. 99 1-4 106-114 2002

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Saba, R., Nakatsuji, N. and Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity upon dorsal cells in the spinal cord.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    J. Neurosci. 23 6 1987-1991 2003

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Mizuseki, K., Sakamoto, T., Watanabe, K., Muguruma, K., Ikeya, M., Nishiyama, A., Arakawa, A., Suemori, H., Nakatsuji, N., Kawasaki, H., Murakami, F. and Sasai, Y. Generation of neural crest-derived peripheral neurons and floor plate cells from mouse and primate embryonic stem cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100 10 5828-5833 2003

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Tada, M., Morizane, A., Kimura, H., Kawasaki, H., Ainscough, J. F. X., Sasai, Y., Nakatsuji, N. and Tada, T. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in ES hybrid cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Dev. Dynamics 227 4 504 –510 2003

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Nagata, M., Takahashi, M., Muramatsu, S., Ueda, Y., Hanazono, Y., Takeuchi, K., Okada, K., Suzuki, Y., Kondo, Y., Suemori, H., Ikeda, U., Nakano, I., Kobayashi, E., Hasegawa, M., Ozawa, K., Nakatsuji, N. and Shimada, K. Efficient gene transfer of a simian immunodeficiency viral vector into cardiomyocytes derived from primate embryonic stem cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    J Gene Medicine 5 11 921-928 2003

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Kasai, S., Chuma, S., Motoyama, N. and Nakatsuji, N. Haploinsufficiency of Bcl-x leads to male specific defects in fetal germ cells: differential regulation of germ cell apoptosis between the sexes.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Devel. Biol. 264 1 202-216 2003

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Chuma, S., Hiyoshi, M., Yamamoto, A., Hosokawa, M. and Nakatsuji, N. Mouse Tudor Repeat-1 (MTR-1) is a novel component of chromatoid bodies/nuages in male germ cells and forms a complex with snRNPs.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Mech. Devel. 120 9 979-990 2003

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Furuya, M., Yasuchika, K., Mizutani, K., Yoshimura, Y., Nakatsuji, N. and Suemori, H. Electroporation of cynomolgus monkey embryonic stem cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Genesis 37 4 180-187 2003

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Suemori, H. and Nakatsuji, N. Growth and differentiation of cynomolgus monkey ES cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Methods in Enzymology "Differentiation of Embryonic Stem Cells" (eds. Wassarman, P. M. and Keller, G. M.) 365   419-429 2003

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Umeda, K., Heike, T., Yoshimoto, M., Shiota, M., Suemori, H., Luo, H.Y., Chui, D.H.K., Torii, R., Shibuya, M., Nakatsuji, N. and Nakahata, T. Development of primitive and definitive hematopoiesis from nonhuman primate embryonic stem cells in vitro.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Development 131 8 1869-1879 2004

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Haruta, M., Sasai, Y., Kawasaki, H., Amemiya, K., Ooto, S., Kitada, M., Suemori, H., Nakatsuji, N., Ide, C., Honda, Y. and Takahashi, M. In vitro and in vivo characterization of pigment epithelial cells differentiated from primate embryonic stem cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 3 1020-1025 2004

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Kimura, H., Tada, M., Nakatsuji, N. and Tada, T. Histone code modifications on pluripotential nuclei of reprogrammed somatic cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Mol. Cell. Biol. 24 13 5710-5720 2004

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Sumi, T., Fujimoto, Y., Nakatsuji, N. and Suemori, H. STAT3 is dispensable for maintenance of self-renewal in nonhuman primate embryonic stem cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Stem Cells 22 5 861-872 2004

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Fujioka, T., Yasuchika, K., Nakamura, Y., Nakatsuji, N. and Suemori, H. A simple and efficient cryopreservation method for primate embryonic stem cells.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Int. J. Dev. Biol. 48 10 1149-1154 2004

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Chuma, S., Kanatsu-Shinohara, M., Inoue, K., Ogonuki, N., Miki, H., Toyokuni, S., Hosokawa, M., Nakatsuji, N., Ogura, A. and Shinohara, T. Spermatogenesis from epiblast and primordial germ cells following transplantation into postnatal mouse testis.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Development 132 1 117-122 2005

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Hatano, S., Tada, M., Kimura, H., Yamaguchi, S., Kono, T., Nakano, T., Suemori, H., Nakatsuji, N. and Tada. T. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Mech. Dev. 122 1 67-79 2005

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Takagi, Y., Takahashi, J., Saiki, H., Morizane, A., Hayashi, T., Kishi, Y., Fukuda, H., Okamoto, Y., Koyanagi, M., Ideguchi, M., Hayashi, H., Imazato, T., Kawasaki, H., Suemori, H., Omachi, S., Iida, H., Itoh, N., Nakatsuji, N., Sasai, Y. and Hashimoto, N. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    J. Clin. Invest. 115 1 102-109 2005

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Kuroda, T., Tada, M., Kubota, K., Kimura, H., Hatano, S., Suemori, H., Nakatsuji, N. and Tada, T. Octamer and Sox elements are required for transcriptional cis-regulation of Nanog gene expression.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Mol. Cell. Biol. 25 6 2475-2485 2005

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Shoji, M., Chuma, S., Yoshida, K., Morita, T. and Nakatsuji, N. RNA interference during spermatogenesis in mice.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Dev. Biol. 282 2 524-534 2005

    全著者名 論文名（招待論文にはInvitedを明記）
    Yamaguchi, S., Kimura, H., Tada, M., Nakatsuji, N. and Tada, T. Nanog expression in mouse germ cell development.
    学術雑誌名 巻 号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    Mech. Dev. Gene Expression Pattern 5 5 639-646 2005

    C.著書（Books）

    全著者名 書名（分担による執筆の場合は編者を記入すること）
    中辻憲夫 ヒトES細胞　なぜ万能か
    出版者名 出版場所 ISBN番号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    岩波書店 東京 4-00-006588-2 1-104 2002

    全著者名 書名（分担による執筆の場合は編者を記入すること）
      「再生医学の基礎—幹細胞と臓器形成」中辻憲夫編著　
    出版者名 出版場所 ISBN番号 初めの頁-終わりの頁 発行年（西暦）
    名古屋大学出版会　 名古屋 4-8158-0466-4 1-29 2003

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