平成１５年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業研究成果報告書概要

プロジェクト・リーダー名		研究経費		総額　 ２６０，０００千円
氏名・所属研究機関 所属部局・職名	栗原　裕基・東京大学 大学院医学系研究科・教授	内訳	平成１２年度	６０，０００千円
			平成１３年度	６０，０００千円
			平成１４年度	８０，０００千円
			平成１５年度	６０，０００千円

氏名	所属機関・部局・職	研究プロジェクトでの役割分担
高倉　伸幸	金沢大学・がん研究所・教授	血管形成過程の細胞間相互作用の解析
尾池　雄一	慶應義塾大学・医学部・講師	遺伝子改変マウスによる血管新生の解析
福原　茂朋	国立循環器病センター研究所・循環器形態部・室員	血管形成に関与する細胞内シグナル伝達機構の解析 （平成１５年３月３１日まで）
栗原由紀子	東京大学・大学院医学系研究科・助手	血管平滑筋の分化機構の解析 （平成１５年４月１日から）
天野　朋和	東京大学・大学院医学系研究科・寄付講座教員	核移植による血管細胞分化の解析 （平成１５年４月１日から）

1) 血管平滑筋の起源として神経堤細胞に含まれる幹細胞に着目し、その分化や形態形成におけるエンドセリン-1(ET-1)の役割とその機序を明らかにするとともに、分化過程で重要な働きを担う２つの転写因子dHANDとPax3の下流遺伝子および結合蛋白に関して分子・細胞・個体レベルの機能解析を進める。 2) 胚個体における神経堤細胞の分化や形態形成機構の解析の新しい手段として、神経堤細胞特異的マーキングと遺伝子導入を可能にする遺伝子改変マウスを作成する。 3) 血管内皮細胞と血液細胞及び壁細胞との細胞間相互作用の介在シグナルとしてアンジオポエチン-1(Ang1)-TIE2系やNeuropilin-1(NP1)に着目し、その血管形成誘導能や血管新生制御のメカニズムを明らかにする。 4) 血管内皮細胞による血管網形成における因子としてアドレノメデュリン(AM)に着目し、その分子機序の解明から安定な血管構築の形成機構を明らかにする。 5) 臓器特異的な血管網構築に異常をきたす遺伝子変異マウスの解析から、細胞間相互作用による臓器の血管化に関わる分子の同定とその機序を明らかにする。 6) 未分化細胞から血管細胞への分化と血管再生への応用に関し、核移植を用いて細胞リプログラミングによる細胞再生を目標とした新しい研究領域を開拓する。

1) 血管平滑筋の起源となる幹細胞を同定し、その分化決定機構に関わる分子シグナル経路とその役割を明らかにする。 2) 血管内皮細胞による血管網形成を制御するシグナルおよび造血幹細胞、壁細胞等との間の細胞間相互作用の媒介シグナルを同定し、その分子メカニズムを明らかにする。 3) 器官や組織に特異的な血管網構築のプログラムがどのような細胞間相互作用によって制御されているか、その役割を担う分子を同定して調節機構を解明する。 4) 1)〜3)の結果に基づき、未分化細胞に対する遺伝子導入による血管細胞への一方向性の分化誘導と血管再生への応用を試みる。

４−１　研究計画、目的に対する成果

1) ET-1が神経堤細胞でのDlx5, 6発現を誘導し、鰓弓・大血管の背腹軸パターン形成を制御していることを明らかにした。また、dHANDが神経堤細胞からの平滑筋分化過程の中間段階への移行あるいは維持に関与している可能性を示した。その標的分子としてカルパイン6を同定し、細胞骨格に作用して細胞形態や増殖を制御する可能性を示した。一方、Pax3による転写活性がコアクチベーターTAZよって亢進することを明らかにし、Pax3-TAZ複合体の役割を示した。 2) ETA受容体遺伝子プロモーターを用いて神経堤細胞にGFPおよびTVA(トリレトロウィルス受容体)が特異的に発現するマウスを作成した。 3) 造血幹細胞はAng1を分泌し、血管新生を誘導することが判明した。また種々の血液細胞に発現するNP-1はVEGFと結合して内皮細胞のFlk-1に強い細胞内シグナルを誘導し、血管形成を正に制御することを明らかにした。また血管内皮細胞に発現するTIE2の恒常的活性化は、壁細胞との強力な接着を誘導して血管新生を抑制するとともに、内皮細胞の細胞周期を遅延化することが判明した。 4) AMホモ接合体の致死性表現型の解析から、AMが血管形成過程で基底膜の形成を含めた血管網の安定な構築に重要な因子であることを示した。 5) メタロプロテアーゼの１つであるADAMTS-1が副腎内血管化に必須の因子であることを明らかにし、臓器特異的血管化に特異的に関わる細胞外基質の存在が示された。

４−２　研究計画、目的外の成果

目的の4)に関連して、細胞分化研究を通してクローン技術を用いた新しい切り口からのアプローチが芽生えた。細胞分化段階によるリプログラミング感受性の違いを検討するため、各種のマウス由来細胞をドナーとしてマウス除核未受精卵に対して核移植を行った。２細胞期になったもののうちで桑実胚・胚盤胞に達したものの割合で比較すると、ES細胞をドナーとした場合は80%以上が桑実胚・胚盤胞を形成するのに対し、同じES細胞を血管細胞への分化条件で培養した場合、その形成率は、２日、６日でそれぞれ約70%, 40%に低下した。培養4.5日でソーティングによってFlk1陽性細胞を採取して核移植を行った場合、その桑実胚・胚盤胞形成率は30％程度であり、in vitroの分化過程で分化段階と核移植後の発生率が相関する可能性が示された。一方、神経堤細胞をドナー細胞として用いた場合、ES細胞と同様の発生率を示した。

４−３　研究成果の展望

1) 神経堤細胞の分化および大血管の形態形成におけるET-1、血管形成におけるAMの役割など、独自の成果を生みだすとともにその分子経路やメカニズムを明らかにすることにより、血管細胞分化と形態形成の関係、細胞間相互作用の役割などに関して新しい視点を開いた。また、AMの血管形成における役割は血管構築の完全性に関わる新しい機序が想定され、将来の血管再生研究にも機能血管の再生という観点から重要な情報を提供し、今後発展させるべき課題と考えられる。 2) 造血と血管形成はこの両者の構成細胞が共通起源から発生することから親密な関係にあることが予想されてきた。実際我々は血液細胞が血管形成にたいし正に促進作用があることを証明しえ、このことは現在虚血性疾患の虚血部位に骨髄造血幹細胞あるいは有核細胞を移植することで血管新生を誘導する新しい血管再生の治療に発展した。今後、血液細胞と血管系細胞の細胞間相互作用による血管新生のメカニズムの解明は血管の研究領域に新しい分野を創出したものと考えられる。 3) マウス未受精卵に対する核移植による血管細胞の分化研究は、核移植後のリプログラミングという新しい視点から血管細胞の分化過程を捉えるものであり、その機能的関連を解析ことにより、細胞の分化制御機構の理解をさらに深めるとともに、体細胞のリプログラミングによる細胞可塑化へと道を開くものであり、血管再生研究に対してその基盤と新たな可能性を提供することが期待される。

４−４　本事業の趣旨に鑑み、果たした役割

本研究により、血管発生研究に対して独自の分子による新しい視点が次々に加えられた。ET-1の研究から、体軸方向の領域決定が鰓弓及び大血管の形態や細胞分化をどのように規定していくかという問題に、１つの手がかりが与えられた。さらに、転写因子機能に関わる新しい分子メカニズム、血管形成における細胞骨格制御とその役割、造血幹細胞や壁細胞などと血管内皮細胞の相互作用の分子メカニズムなどに関して、独創性と発展性の高い成果が得られ、それぞれが新しい領域を開く糸口になると考えられた。 　血管治療への応用研究に対する基盤という点でも、大きな成果が挙げられた。AMの血管形成における役割は、強固な構造を保った機能血管の再生という観点から重要な情報を提供した。また、従来血管新生を抑制する手段としては、血管内皮細胞の細胞死誘導あるいは増殖抑制、基質の消化を含め血管内皮細胞の移動の抑制に焦点が当てられてきた。今回の研究により血管内皮細胞と血管壁細胞の細胞間相互作用により血管形成の制御が可能であることが証明され、血管新生の制御に壁細胞の細胞活性を考慮した新しい血管治療概念が発生すると考えられる。 　さらに、本研究によって派生した核移植による血管細胞分化の研究は、全く未知の研究領域に踏み込むものである。核移植後のリプログラミングと細胞分化の関係を系統的に解析し、その関連を分子レベルで明らかにしようとする研究はほとんど報告されておらず、特にリプログラミングの観点からドナー細胞の分化特性を解析しようとする研究は行われていない。こうした点で本研究の萌芽は、未来開拓の趣旨に合致するものと考えられる。

(1)血管新生	(2)血管内皮細胞	(3)血管壁細胞
(4)血管平滑筋細胞	(5)細胞分化	(6)形態形成
(7)転写因子	(8)細胞間相互作用	(9)核移植

A.学術雑誌論文（Journal Papers）

全著者名	論文名
Ieda M, Fukuda K, Hisaka Y, Kimura K, Kawaguchi H, Fujita J, Shimoda K, Takeshita E, Okano H, Kurihara Y, Kurihara H, Ishida J, Fukamizu A, Federoff HJ, Ogawa S	Endothelin-1 regulates cardiac sympathetic innervation in the rodent heart by controlling nerve growth factor expression.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
J. Clin. Invest.	???	???	???	??? (in press)

全著者名	論文名
Ozeki H, Kurihara Y, Tonami K, Watatani S, Kurihara H.	Endothelin-1 regulates the dorsoventral branchial arch patterning in mice.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Mech.Dev	???	???	???	??? (in press)

全著者名	論文名
Maekawa H, Oike Y, Kanda S, Ito Y, Yamada Y, Kurihara H, Nagai R, Suda T.	Ephrin-B2 induces migration of endothelial cells through the phosphatidylinositol-3 kinase pathway and promotes angiogenesis in adult vasculature.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.	23	11	2008-2014	2003

全著者名	論文名
Yamada Y, Oike Y, Ogawa H, Ito Y, Fujisawa H, Suda T, Takakura N.	Neuropilin-1 on hematopoietic cells as a source of vascular development.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Blood	101	5	1801-1809	2003

全著者名	論文名
Shindo T, Kurihara H, Maemura K, Kurihara Y, Ueda O, Suzuki H, Kuwaki T, Ju K-H, Wang Y, Morita H, Oh-hashi Y, Kumada M, Kimura K, Nagai R, Yazaki Y.	Renal damage and salt-dependent hypertension in aged transgenic mice overexpressing endothelin-1.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
J. Mol. Med.	80	2	105-116	2002

全著者名	論文名
Imai Y, Shindo T, Sata M, Memura K, Saito Y, Akishita M, Osuga J, Ishibashi S, Tobe K, Maekawa H, Oh-hashi Y, Morita H, Kurihara Y, Yazaki Y, Nagai R, Kurihara H.	Resistance to neointimal hyperplasia and fatty streak formation in adrenomedullin overexpression mice.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.	22	8	1310-1315	2002

全著者名	論文名
Sano H, Ueda Y, Takakura N, Takemura G, Doi T, Kataoka H, Murayama T, Xu Y, Sudo T, Nishikawa S, Nishikawa S, Fujiwara H, Kita T, Yokode M.	Blockade of platelet-derived growth factor receptor-beta pathway induces apoptosis of vascular endothelial cells and disrupts glomerular capillary formation in neonatal mice.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
JAm. J. Pathol.	161	1	135-143	2002

全著者名	論文名
Suenobu S, Takakura N, Inada T, Yamada Y, Yuasa H, Zhang XQ, Sakano S, Oike Y, Suda T.	A role of EphB4 receptor and its ligand, ephrin-B2, in erythropoiesis.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Biochem. Biophys. Res. Commun.	293	3	1124-1131	2002

全著者名	論文名
Yuasa H, Takakura N, Shimomura T, Suenobu S, Yamada T, Nagayama H, Oike Y, Suda T.	Analysis of human TIE2 function on hematopoietic stem cells in umbilical cord blood.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Biochem. Biophys. Res. Commun.	298	5	731-737	2002

全著者名	論文名
Morita H, Kurihara H, Yoshida S, Saito Y, Shindo T, Oh-hashi Y, Kurihara Y, Yazaki Y, Nagai R.	Diet-induced hyperhomocysteinemia exacerbates neointima formation in rat carotid arteries after baloon injury.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Circulation	103	1	133-139	2001

全著者名	論文名
Ho MCY, Lo ACY, Kurihara H, Yu ACH, Chung SK.	Endothelin-1 protects astrocytes from hypoxic/ischemic injury.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
FASEB J.	15	3	618-626	2001

全著者名	論文名
Imai Y, Shindo T, Maemura K, Kurihara Y, Nagai R, Kurihara H.	Evidence for the physiological and pathological roles of adrenomedullin from genetic engineering in mice.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Ann. NY. Acad. Sci.	947	???	26-34	2001

全著者名	論文名
Shindo T, Kurihara Y, Nishimatsu H, Moriyama N, Kakoki M, Wang Y, Imai Y, Ebihara A, Kuwaki T, Ju K-H, Minamino N, Kangawa K, Ishikawa T, Fukuda M, Akimoto Y, Kawakami H, Imai Y, Imai T, Morita H, Yazaki Y, Nagai R, Hirata Y, Kurihara H.	Vascular abnormalities and elevated blood pressure in mice lacking adrenomedullin gene.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Circulation	104	16	1964-1971	2001

全著者名	論文名
Oh-hashi Y, Shindo T, Kurihara Y, Imai T, Wang Y, Morita H, Imai Y, Kayaba Y, Nishimatsu H, Suematsu Y, Hirata Y, Yazaki Y, Nagai R, Kuwaki T, Kurihara H.	Elevated sympathetic nervous activity in mice deficient in ?CGRP.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Circ. Res.	89	11	983-990	2001

全著者名	論文名
Koga K, Todaka T, Morioka M, Hamada J, Kai Y, Yano S, Okamura A, Takakura N, Suda T, Ushio Y.	Expression of angiopoietin-2 in human glioma cells and its role for angiogenesis.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Cancer Res.	61	16	6248-6254	2001

全著者名	論文名
Zhang XQ, Takakura N, Oike Y, Inada T, Gale NW, Yancopoulos GD, Suda T.	Stromal cells expressing ephrin-B2 promote the growth and sprouting of ephrin-B2(+) endothelial cells.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Blood	98	4	1028-1037	2001

全著者名	論文名
Sano H, Sudo T, Yokode M, Murayama T, Kataoka H, Takakura N, Nishikawa S, Nishikawa S, Kita T.	Functional blockade of platelet-derived growth factor receptor-beta but not of receptor-alpha prevents vascular smooth muscle cell accumulation in fibrous cap lesions in apolipoprotein E-deficient mice.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Circulation	103	24	2955-2960	2001

全著者名	論文名
Yamada Y, Takakura N, Yasue H, Ogawa , Fujisawa H, Suda T.	Exogenous clustered neuropilin-1 enhances vasculogenesis and angiogenesis.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Blood	97	6	1671-1678	2001

全著者名	論文名
Shindo T, Kurihara H, Maemura K, Kurihara Y, Kuwaki T, Izumida T, Minamino N, Ju K-H, Morita H, Oh-hashi Y, Kumada M, Kangawa K, Nagai R, Yazaki Y.	Hypotension and resistance to lipopolysaccharide-induced shock in transgenic mice overexpressing adrenomedullin in their vasculature.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Circulation	101	19	2309-2316	2000

全著者名	論文名
Kurihara Y*, Kurihara H*, Morita H, Cao W-H, Ling G-Y, Kumada M, Kimura S, Nagai R, Yazaki Y, Kuwaki T.	Role of endothelin-1 in stress response in the central nervous system.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Am. J. Physiol.	279	2	R515-R521	2000. (*equal contribution)

全著者名	論文名
Shindo T, Kurihara H, Kuno K, Yokoyama H, Wada T, Kurihara Y, Imai T, Wang Y, Ogata M, Oh-hashi Y, Morita H, Ishikawa T, Nagai R, Yazaki Y, Matsushima K.	ADAMTS-1: a metalloproteinase-disintegrin essential for normal growth, fertility and organ morphology and function.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
J. Clin. Invest.	105	10	1345-1352	2000

全著者名	論文名
Takakura N, Watanabe T, Suenobu S, Yamada Y, Noda T, Ito Y, Satake M, Suda T.	A role for hematopoietic stem cells in promoting angiogenesis.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Cell	102	2	199-209	2000

全著者名	論文名
Hamada K, Oike Y, Takakura N, Ito Y, Jussila L , Dumont DJ, Alitalo K, Suda T.	VEGF-C signaling pathways through VEGFR-2 and VEGFR-3 in vasculo-angiogenesis and Hematopoiesis.
学術雑誌名	巻	号	ページ	発行年
Blood	96	12	3793-3800	2000