内皮細胞が産生し、negative feedback調節機能を有する新規血管新生抑制因子
　cDNAチップを用いて、臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をVEGFで刺激したときに変動する遺伝子を網羅的に解析し、刺激後24時間の時点で２倍以上に誘導されたものの中から、血管新生抑制活性を有する新規の因子を同定した。Northern blot法から、本因子の発現はVEGF刺激によりHUVECやそれ以外のヒト内皮細胞において強く誘導されること、その他ではbFGFによっても誘導されることが確認された。本因子は、内皮細胞に対して選択的に作用して内皮細胞の遊走、増殖、管腔形成を有意に抑制し、in vivoにおいても血管新生抑制活性を示したことから"vasohibin"と命名した。ヒトvasohibinは365個のアミノ酸からなり、マウスカウンターパートはヒトとアミノ酸レベルで約９４％相同である。ヒトの各臓器の発現をNorther blotで解析すると、心臓、脳、胎盤に強く発現し、免疫染色の結果、その発現は血管内皮に選択的であった。以上より、vasohibinは内皮細胞に選択的に発現し、しかも内皮細胞に対して選択的に抑制作用を発揮する分子と考えられる。VEGFによる内皮細胞の遊走促進作用は、濃度反応曲線はベル型を示し、低い濃度で強く作用し、高濃度では逆に減弱するが、vasohibinの発現をknockdownすると、高濃度VEGFでの作用減弱が消失した。すなわち、vasohibinはVEGFによって内皮細胞に誘導されて、VEGFの作用を抑制するnegative feedback調節分子と考えられる。本遺伝子を癌細胞の安定導入すると、癌細胞自身の増殖には影響は与えないが、腫瘍血管新生の抑制のため、動物に移植した際のin vivoにおける癌の発育は抑制された。また、preliminaryではあるが、本遺伝子を過剰発現したマウスES細胞の内皮細胞へ分化は遅延し、同細胞を用いたトランスジェニックマウスでは、胎生期の血管形成が著しく抑制されたのに対し、本遺伝子をknockdownしたマウスES細胞では内皮細胞の分化が著明に早まることを観察している。

卵胞液中に存在する血管新生抑制因子
　ウシ卵胞液から単離したF-spondinは、血管平滑筋細胞の増殖を促進する作用を有しているが、血管新生に対する作用を検討したところ血管新生を抑制することが明らかにした。そこで、その機序について検討した結果、F-spondinは血管内皮細胞の遊走を阻害し、その作用は血管内皮細胞のインテグリンαvβ3を選択的に阻害するためであることを明らかにした。さらに、F-spondin分子を構成する３つのドメイン構造のどこに阻害活性があるのかを明らかにすること目的に、それぞれのドメインをコードするフラグメント蛋白を作成して解析した結果、その活性中心はロンボスポンジン３型リピートに存在することを同定した。

血管新生を抑制的に調節する転写因子HEX
　転写因子HEXがマウス胎児の血管形成の初期に内皮細胞に発現することが知られていた。そこでHEXが、成熟個体の血管新生部位にも発現しているかどうかを調べたところ、そこでも発現していることが確認された。しかし、HEXが血管形成に対してどのような機能を果たしているのかについては良く分かったいなかった。そこで、HEX遺伝子を内皮細胞に導入して検討したところ、HEXはVEGFの1型受容体や2型受容体、さらにはTIE受容体の発現を抑制して、血管新生の刺激を阻止する抑制性の機能を有していることを明らかにした。

転写因子VEZF1の血管新生における役割：stathminとの関係
　転写因子VEZF1もまた、マウス胎生期の血管内皮細胞に発現することが明らかとなっていたが、その機能は不明であった。まず、VEZF1が成熟個体の血管新生部位にも発現していることを確認した。内皮細胞のVEZF1の発現をknockdownすると、内皮細胞の増殖、遊走、ネットワーク形成能は著しく抑制され、in vivoにおいても血管新生が阻害された。そこで、VEZF1の標的遺伝子の解析を進めたところstathminが同定され、stathminによるチュブリンのターンオーバーが血管新生において極めて重要であることを示した。

転写因子ETS-1によるAngiopoietin-2の遺伝子発現調節
　Angiopoietin-2は、血管新生が開始する際に内皮細胞に発現し、ペリサイト離脱を来たすが、その発現調節にメカニズムは不明であった。転写因子ETS-1を内皮細胞に遺伝子導入するとAngiopoietin-2の遺伝子発現が誘導されることからAngiopoietin-2遺伝子の５'上流約3kbを調べた結果、この領域にはETS結合配列がクラスターしており、特に存在するETS結合配列が重要であり、転写因子ETS-1が同部位に結合してAngiopoietin-2の発現を誘導することを明らかにした。

血液細胞系列の起源としての血管内皮の意義
　マウス胎仔からFACSを用いて分離した血管内皮細胞が血液細胞に分化する能力を持つことをex vivoの培養系により既に示していた。本プロジェクトでは、この血管内皮細胞をbusulfan投与したSCIDマウス新生仔肝に移植することによってin vivoにおけるリンパ球造血を再構築できることを確認した。次に、マウス胚性幹細胞（ES細胞）の試験管内分化系を用いて細胞系譜解析を行い、側部中胚葉細胞から胚型赤血球系列と血管内皮細胞系列が発生し、さらに血管内皮細胞から成体型血液細胞系列が発生するという一連の分化経路を証明した。このことから、血液細胞系列の起源としての血管内皮の意義は、造血幹細胞を含む成体型血液細胞系列に特異的な発生プログラムを内包することにあると考えられる。

血管内皮に内包される血液細胞発生プログラム
　このプログラムの少なくとも一部がRunx1/AML1であることを、同遺伝子のノックアウトマウス胎仔から分離された血管内皮細胞が血液細胞分化能を持たないことを示すことにより証明した。さらに、血管内皮細胞に分化する以前の中胚葉の段階で発現するTal1/SCLが、将来の血管内皮に内含される血液細胞発生プログラムの実効性を規定することを、tal1ノックアウトES細胞の試験管内レスキュー実験によって明らかにした。血管内皮細胞の分化プログラムと血液細胞の発生プログラムが一時的には共存できるものの最終的には排他的であることは、flk-1遺伝子のエンハンサー活性の発現によって定義される血管内皮細胞の成熟過程が血液細胞分化能の消失をもたらすことから確認された。

ES細胞による血管の構築
　ES細胞を利用した再生医学の展開をめざした基礎研究の一環として、ES細胞からin vitroおよびin vivoで血管を新たに構築することを試みた。まず、ES細胞から分化誘導した側部中胚葉細胞が血管内皮細胞と血管平滑筋細胞に分化する能力を持つことを利用して、側部中胚葉細胞をコラーゲンゲル内で３次元培養することにより、内皮細胞と周皮細胞から成る血管様構造を構築することに成功した。次いで、神経膠芽腫細胞株をヌードマウス皮下に移植する腫瘍血管新生モデルにおいて、ES細胞からin vitroで分化誘導した血管内皮細胞を腫瘍の周囲に移植することによって、これが腫瘍血管の形成に効率よく寄与することを証明した。さらに、ES細胞から分化誘導した細胞を移植医療に利用するにあたっては培養系の無血清化が必須であることから、ES細胞に由来する側部中胚葉細胞から血管内皮細胞にいたる分化誘導を無血清下で行う培養系を開発した。この培養系を利用して、血管内皮細胞の生存維持に必要なVEGFに対する濃度依存性が、デコイとして働くVEGFR-1の発現によって規定されることを明らかにした。

VEGF-C/VEGFR-3に依存した血管内皮の密着性維持
　神経膠芽腫細胞株をヌードマウス皮下に移植する腫瘍モデルにおいて、VEGFR-3に対する阻害抗体の投与が腫瘍血管新生と腫瘍増殖を抑制することを見出した。組織学的な解析から、VEGFR-3の阻害により新生血管の内皮に亀裂が生じ出血をきたすことが確認された。次に、ES細胞からin vitroで分化誘導した血管内皮細胞を細胞学的に解析することにより内皮細胞レベルにおけるVEGFR-3の機能を検討した。VEGFによるVEGFR-2の刺激および抗体によるVEGFR-3の阻害が何れも血管内皮細胞同士の密着性の消失をもたらすことから、VEGF-C/VEGFR-3シグナルがVEGF/VEGFR-2シグナルを抑制的に調節し血管内皮の密着性を維持することが明らかとなった。

Angiopoietin-1による血管リモデリングの促進
　血管リモデリングにおける血管壁細胞の役割を解析するために、マウス新生仔の網膜血管の発生をモデルとして、PDGFRβに対する阻害抗体を投与することにより壁細胞の分化を伴わない血管をin vivoで形成させる実験系を開発した。その結果、壁細胞を伴わない血管形成においては血管リモデリングが阻害されるが、Angiopoietin-1をさらに投与することによって壁細胞がなくてもリモデリングが進行することを見出した。これにより、Angiopoietin-1は血管内皮細胞に対する直接の作用として血管リモデリングを促進的に調節することが証明された。

転写因子RBP-Jの機能
　転写因子RBP-Jは、個体発生において様々な機能を持つNotchシグナル伝達経路の主要な下流分子である。RBP-J遺伝子のノックアウトマウスは胎生致死となるため、その詳細な機能については不明であった。側部中胚葉に由来する細胞系列におけるRBP-Jの役割を明らかにするために、RBP-J欠損ES細胞を試験管内分化系に応用し解析を行った。RBP-J欠損ES細胞は、心筋細胞、血管内皮細胞、胚型赤血球、成体型血液細胞にそれぞれ分化し、これらの細胞系列の分化決定にRBP-Jが少なくとも必須ではないことが示された。しかし、心筋細胞の出現頻度は野生型ES細胞と比較してRBP-J欠損ES細胞で非常に高く、この形質はRBP-Jの発現を回復させることにより解消した。この観察から、RBP-Jは心筋細胞の分化決定に関して何らかの役割を持つことが明らかとなった。