平成15年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業研究成果報告書概要



研究推進分野名   血管新生と分化制御
 
研究プロジェクト名   組織血管化の制御とその分子機構
 
(英文名)   Control of Tissue Vascularity and its Molecular Mechanism
 
研究期間   平成11年度〜平成15年度

プロジェクト・リーダー名 研究経費 総額  367,929千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名
開 祐司・京都大学
再生医科学研究所・教授
内訳 平成11年度 75,000千円
平成12年度 67,986千円
平成13年度 74,943千円
平成14年度 75,000千円
平成15年度 75,000千円

1.研究組織

氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
古瀬 幹夫 京都大学・大学院医学研究科・助教授 血管内皮の組織化とその分子機構
宿南 知佐 京都大学・再生医科学研究所・助教授 組織血管化の制御とその分子機構

2.研究計画の概要

 血管侵入抵抗性組織に特異的に発現する血管新生抑制因子のchondromodulin-I (ChM-I)とtenomodulin (TeM)の構造と生物活性の面から血管侵入抵抗性バリアを解析する。また、血管内皮細胞のタイトジャンクションを構成するClaudin-5,およびClaudin-12の遺伝子ノックアウトマウスを作製、解析することによって、血管のバリア機能の個体における意義と、その破綻によって生じる病態のメカニズムを明らかにする。
1) MMPによるChM-Iの代謝を解析する。前年度に作成したChM-Iの構造ドメインに特異的な抗ペプチド抗体を駆使して、ChM-I分子の切断様態を解析する。
2) リウマチ関節炎に対するChM-Iの作用を検討する。その一環として、ChM-I遺伝子欠失マウスをもどし交配によって遺伝的背景を変更した後、関節炎誘発モデルを作成する。
3) Tenomodulin C-末端ドメインの血管新生抑制活性を確立する。さらに、Tenomodulin遺伝子欠失マウスを作出する。
4) 成体マウスにおける解析を目的としてclaudin-5遺伝子のコンディショナル遺伝子欠失マウスを作製する。また、claudin-5以外に脳血管に発現するclaudin-12の遺伝子欠失マウスを作製し、血管のバリア機能に与える影響を解析する。

3.研究目的

 血管新生の制御には種々の細胞間シグナル分子が介在する。血管は臓器や組織の形成・維持に必須で、血管新生の制御とその異常は、個体発生のみならず多くの病態形成とも深く関わりあっている。本研究では、血管を完備した一つの器官として捉え、「組織血管化」の現象を組織間相互作用と細胞分化制御の観点から解析する。特に、組織への血管侵入を制御する正負の細胞間シグナル分子と、その標的となる血管内皮細胞の高次構築の面から解析することにより、血管新生制御に基づく新規治療技術開発のための基盤を確立する。
1. 組織血管化の制御とその分子機構:豊富な血管網が存在する間充織とは、対照的に無血管組織として知られる軟骨組織に由来する血管新生抑制因子ChM-Iの構造と生物活性の面から血管侵入抵抗性バリアを分子レベルで解析する。
2. 血管内皮の組織化とその分子機構:血管内皮細胞のタイトジャンクションを構成するClaudin-5の遺伝子ノックアウトマウスを作製、解析することによって、血管のバリア機能の個体における意義と、その破綻によって生じる病態のメカニズムを明らかにする。

4.研究成果の概要

4−1 研究計画、目的に対する成果
1. 組織血管化の制御とその分子機構
(ア) 糖鎖修飾された組換えヒトChM-I (rhChM-I)は、糖鎖修飾のない組換え体(NG-hChM-I)と異なりMMP-13で切断されるものの、MMP-9では切断されなかった。精製されるペプチド断片の解析から、主な分解産物のN-末端は、Gln50であり、C-末端はインタクトに保持されていることが示唆された。
(イ) 胸腺皮質にChM-Iが発現していることを確認した。そこで、ヒト組換えChM-Iタンパク質を用いて、ChM-IのT細胞機能及び実験的リウマチ関節炎に対する作用を検討した。その結果、ChM-IがT細胞応答ならびに滑膜細胞の増殖を抑制することが判明した。
(ウ) TeMタンパク質のC-末端領域をアデノウイルスにより細胞に強制発現させた。その結果、血管内皮細胞に発現させると、細胞遊走・細胞増殖・管腔形成など血管新生の各ステップが阻害された。また、マウスに移植したメラノーマの腫瘍血管新生を抑制すると共に著明な抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。
2. 血管内皮の組織化とその分子機構
(ア) 血管内皮細胞のバリア機能の異常:帝王切開によって得た出産直前のマウス生存胚の心臓から血中に水溶性トレーサーを導入し、脳血管からの漏出を解析する実験系を構築した。その結果、Claudin-5遺伝子欠失マウスでは、脳血管のバリア機能が分子量依存的に破綻している事を明らかにした。


4−2 研究計画、目的外の成果
1. ニワトリ胚卵黄静脈又は尿膜静脈から、ガラスキャピラリーを用いて墨汁を注入することにより血管網を可視化する方法を確立した。in situ hybridization法と組み合せることにより、遺伝子発現のパターンと毛細血管網のパターン化を詳細に解析することが可能となった。

2. リウマチ関節炎は異常な血管新生を伴うので、ChM-Iが抑制的に作用することは理解できる結果であった。しかし、ChM-IがT細胞応答ならびに滑膜細胞の増殖を抑制することは予想外の結果で、新規治療技術の新たな開発シーズとなることが期待される成果であった。
3. 海外からClaudin-1が脳血管内皮細胞に発現していると報告された。そこで、急遽、Claudin-1遺伝子欠失マウスの作出を、本プロジェクトに組込んだ。その結果、Claudin-1は内皮細胞に発現しないことが確立された。同時に、水分蒸発に対する皮膚バリア機能が破綻しており、生後、極度の脱水によって死亡することが判明した。これは、陸生動物の皮膚バリアにおいてタイトジャンクションが役割を果たしていないという通説を覆すもので、皮膚科学に新しい概念を提唱した。


4−3 研究成果の展望
 近年、VEGFやAngiopoietinを中心として生理的あるいは病的血管新生の誘導と維持に関する研究がライフサイエンスの中で体系を整えてきた。これに対して、血管侵入に対して抵抗性を保持する生理的な仕組みが存在することが指摘されつつも、分子レベルの解析を許す基本的な標的分子が明確ではなく、血管新生の負の制御についての体系的理解に乏しかった。血管網を完備した一つの器官として捉えることが可能になり、組織に血管網が張り巡らされる「組織血管化」の現象は、血管新生の正の制御と負の制御の両面が相俟って初めて細胞あるいは組織間相互作用として体系的な理解が可能になる。今回、組織に特異的な血管新生抵抗形質を、軟骨由来血管新生抑制因子として同定・クローニングしたChM-Iを突破口として重点的に解析することができた。この過程で新たな組織特異的血管新生抑制分子TeMが発見された。その結果、単に軟骨組織に特異な形質としての「血管侵入抵抗性」の研究は、間葉系組織内の血管侵入抵抗性形質の領域化に拡張されることが示された。リウマチ関節炎におけるT細胞応答の抑制や骨リモデリングに対する作用など新たな周辺領域への新たな展望が拓けると同時に、活性型組換えタンパク質やアデノウイルス等を利用した遺伝子導入によって、新規の治療技術へのシーズ開拓に展開することが期待される。
 Claudinを切り口に進めた血管内皮細胞のタイトジャンクションに関する研究では、Claudin-5遺伝子欠失マウスに関する成果により、血液脳関門におけるタイトジャンクションの重要性を世界に先駆けて個体レベルで証明することができた。これによりClaudinを標的とした血液脳関門におけるドラッグデリバリー法の開発に向けた重要な基礎データを提供した。さらに、血液脳関門の破綻が個体を致死に導くメカニズム、Claudin-5遺伝子の欠失が脳以外の臓器おける血管透過性にあたえる効果など解明されるべき新たに課題と展開が明確に方向づけられた。


4−4 本事業の趣旨に鑑み、果たした役割
 急速な高齢化社会の到来と共に、臓器や器官を構成する細胞群や組織間の統御変調から派生する慢性疾患への対処が次世代医療における中心的な課題となっている。血管新生病変と呼ばれる一群の病変は、このような慢性疾患の典型を示し、糖尿病性網膜症をはじめとする眼内血管新生疾患や腫瘍血管造成などが含まれる。これは、「組織血管化」の制御に係る病変である。そこで、血管侵入に対する生理的な抑制機構に基づく新規治療技術の開発シーズの開拓へとつながると期待された。本プロジェクトでは、軟骨組織に血管新生抑制因子ChM-Iを発見し、これによって区画化される『Anti-Angiogenic Barrier』の成立と機能という新しい概念に基づいて、組織血管化に係る組織間相互作用を解析した。その過程で、強靱結合組織の血管侵入抵抗性にかかわる新たな血管新生抑制分子TeMが発見され、血管新生抑制タンパク質の新規な構造モチーフを確立した。遺伝子組換え技術により、これが腫瘍血管新生やリウマチ関節炎などに応用できること示したのみならず、ChM-I遺伝子欠失マウスの解析から骨粗鬆症などに応用が期待される骨リモデリング因子としての作用をも突き止めることに成功した。一方、血管内皮細胞を横切る物質輸送の制御は、生理的状態、あるいは病態における血管の透過性と密接に関係することから、きわめて重要な研究課題の一つである。ところが、傍細胞経路特異的な透過性の解析はほとんど手つかずのままであり、我々によるタイトジャンクションの接着分子Claudinファミリーの発見がその解析に道を拓くものと期待された。そこで、本プロジェクトにおいてClaudin-5遺伝子欠失マウスを世界に先駆けて作出し、期待通り、脳血管関門の破綻とその個体への影響が明らかなった。この成果はタイトジャンクションを標的とした血管透過性に関する分子生物学的研究を個体レベルで行った先駆けであると同時に、Claudinをターゲットとした脳血管関門におけるドラッグデリバリー法の開発の可能性についても多くの示唆を残した。これらの点で、本研究プロジェクトは、将来の医学への応用に十分貢献できたと考える。

5.キーワード

(1)血管新生抑制因子 (2)Chondromodulin-I (3)Tenomodulin
(4)骨リモデリング因子 (5)腫瘍血管新生 (6)リウマチ関節炎
(7)タイトジャンクション (8)Claudin (9)血管透過性

6.研究成果発表状況

A.学術雑誌論文(Journal Papers)
全著者名 論文名
Yusuke Oshima, Koji Sato, Fumi Tashiro, Jun-ichi Miyazaki, Koji Nishida, Yuji Hiraki, Yasuo Tano, and Chisa Shukunami Anti-angiogenic action of the C-terminal domain of tenomodulin that shares homology with chondromodulin-I
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Cell Sci. ??? ??? ??? 2004(in press)

全著者名 論文名
Keigo Setoguchi, Yoshikata Misaki, Kimito Kawahata, Kota Shimada, Takuo Juji, Sakae Tanaka, Hiromi Oda, Chisa Shukunami, Yuriko Nishizaki, Yuji Hiraki, and Kazuhiko Yamamoto Suppression of T cell responses by chondromodulin I, a cartilage-derived angiogenesis inhibitory factor: therapeutic potential in rheumatoid arthritis
学術雑誌名 ページ 発行年
Arthritis Rheum. 50 3 828-839 2004

全著者名 論文名
Matthias Wahl, Chisa Shukunami, Ulrich Heinzmann, Kumiko Hamajima, Yuji Hiraki, and Kenji Imai Transcriptome analysis of early chondrogenesis in ATDC5 cells induced by bone morphogenetic protein 4.
学術雑誌名 ページ 発行年
Genomics 83 1 45-58 2004

全著者名 論文名
Miho Matsuda, Akiharu Kubo, Mikio Furuse, and Shoichiro Tsukita A peculiar internalization of claudins, tight junction-specific adhesion molecules, during the intercellular movement of epithelial cells
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Cell Sci. 117 7 1257-1257 2004

全著者名 論文名
Naoko Watanabe, Yoko Tezuka, Kenji Matsuno, Seiji Miyatani, Naoko Morimura, Masafumi Yasuda, Ryoji Fujimaki, Kazuki Kuroda, Yuji Hiraki, Nobumichi Hozumi, and Ken-ichi Tezuka Suppression of differentiation and proliferation of early chondrogenic cells by Notch.
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Bone Miner. Metab. 21 6 344-352 2003

全著者名 論文名
Takehiro Nitta, Masaki Hata, Shimpei Gotoh, Yoshiteru Seo, Hiroyuki Sasaki, Nobuo Hashimoto, Mikio Furuse, and Shoichiro Tsukita Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Cell Biol. 161 3 653-660 2003

全著者名 論文名
Hiroyuki Sasaki, Chiyuki Matsui, Kyoko Furuse, Yuko Mimori-Kiyosue, Mikio Furuse, and Shoichiro Tsukita Dynamic behavior of paired claudin strands within apposing plasma membranes
学術雑誌名 ページ 発行年
PNAS 100 7 3971-3976 2003

全著者名 論文名
Kazumasa Morita, Hiroyuki Sasaki, Kyoko Furuse, Mikio Furuse, Shoichiro Tsukita, and Yoshiki Miyachi Expression of claudin-5 in dermal vascular endothelia
学術雑誌名 ページ 発行年
Exp. Dermatology 12 3 289-295 2003

全著者名 論文名
Yusuke Oshima, Chisa Shukunami, Junichi Honda, Koji Nishida, Fumi Tashiro, Junichi Miyazaki, Yuji Hiraki, and Yasuo Tano Expression and localization of tenomodulin, a transmembrane type chondromodulin-I-related angiogenesis inhibitor, in mouse eyes
学術雑誌名 ページ 発行年
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 5 1814-1823 2003

全著者名 論文名
Yuko Nakamichi, Chisa Shukunami, Takashi Yamada, Ken-ichi Aihara, Hirotaka Kawano, Takashi Sato, Yuriko Nishizaki, Yoko Yamamoto, Masayo Shindo, Kimihiro Yoshimura, Hiroshi Kawaguchi, Yuji Hiraki, and Shigeaki Kato Chondromodulin I is a bone remodeling factor
学術雑誌名 ページ 発行年
Mol. Cell Biol. 23 2 636-644 2003

全著者名 論文名
Shoichiro Tsukita and Mikio Furuse Claudin-based barrier in simple and stratified epithelial cellular sheets(Invited)
学術雑誌名 ページ 発行年
Curr. Opin. Cell Biol. 14 5 531-536 2002

全著者名 論文名
Yumiko Kiuchi-Saishin, Shimpei Gotoh, Mikio Furuse, Akiko Takasuga, and Shoichiro Tsukita Differential expression patterns of claudins, tight junctions membrane proteins, in mouse nephron segments
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Am. Soc. Nephorol. 13 4 875-886 2002

全著者名 論文名
Kimihide Kusafuka, Yuji Hiraki, Chisa Shukunami, Teruo Kayano, and Tamiko Takemura Cartilage-specific matrix protein, chondromodulin-I (ChM-I), is a strong angio-inhibitor in endochondral ossification of human neonatal vertebral tissues in vivo: relationship with angiogenic factors in the cartilage.
学術雑誌名 ページ 発行年
Acta Histochem. 104 2 167-175 2002

全著者名 論文名
Shoichiro Tsukita, Mikio Furuse, and Masahiko Itoh Multifunctional strands in tight junctions (Invited)
学術雑誌名 ページ 発行年
Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 4 285-293 2001

全著者名 論文名
Chisa Shukunami, and Yuji Hiraki Role of cartilage-derived anti-angiogenic factor, chondromodulin-I, during endochondral bone formation (Invited)
学術雑誌名 ページ 発行年
Osteoarthritis Cartilage, 9 Suppl A S91-101 2001

全著者名 論文名
Sherri Weiss Sachdev, Uwe H. Dietz, Yusuke Oshima, Michael R. Lang, Ela W. Knapik, Yuji Hiraki, and Chisa Shukunami Sequence analysis of zebrafish chondromodulin-1 and expression profile in the notochord and chondrogenic regions during cartilage morphogenesis
学術雑誌名 ページ 発行年
Mech. Dev. 105 1-2 157-162 2001

全著者名 論文名
Kimihide Kusafuka, Yuji Hiraki, Chisa Shukunami, Akira Yamaguchi, Teruo Kayano, and Tamiko Takemura Cartilage-specific matrix protein chondromodulin-I is associated with chondroid formation in salivary pleomorphic adenomas: immunohistochemical analysis
学術雑誌名 ページ 発行年
Am. J. Pathol. 158 4 1465-1472 2001

全著者名 論文名
Akio Shimizu, Kouichirou Tada, Chisa Shukunami, Yuji Hiraki, Tsutomu Kurokawa, Noriko Magane, and Misuzu Seo A Novel Alternatively Spliced Fibroblast Growth Factor Receptor 3 Isoform Lacking the Acid Box Domain Is Expressed during Chondrogenic Differentiation of ATDC5 Cells
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 276 14 11031-11040 2001

全著者名 論文名
Haruko Funaki, Shoichi Sawaguchi, Kiyoshi Yaoeda, Yu Koyama, Eishin Yaoita, Shigeo Funaki, Motohiro Shirakashi, Chisa Shukunami, Yuji Hiraki, Haruki Abe, and Tadashi Yamamoto Expression and localization of angiogenic inhibitory factor, chondromodulin-I, in adult rat eye
学術雑誌名 ページ 発行年
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 6 1193-1200 2001

全著者名 論文名
Mikio Furuse, Kyoko Furuse, Hiroyuki Sasaki, and Shoichiro Tsukita Conversion of Zonula Occludens from tight to leaky strand type by introducing claudin-2 into MDCK I cells
学術雑誌名 ページ 発行年
J.Cell Biol. 153 2 263-272 2001

全著者名 論文名
Chisa Shukunami, Yusuke Oshima, and Yuji Hiraki Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene
学術雑誌名 ページ 発行年
Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 5 1323-1327 2001

全著者名 論文名
Tsuneaki Takao, Toru Iwaki, Jun Kondo, and Yuji Hiraki Immunohistochemistry of chondromodulin-I in the human intervertebral discs with special reference to the degenerative changes
学術雑誌名 ページ 発行年
Histochem. J. 32 9 545-550 2000

全著者名 論文名
Yuji Hiraki, and Chisa Shukunami Chondromodulin-I as a novel cartilage-specific growth-modulating factor (Invited)
学術雑誌名 ページ 発行年
Pediatr. Nephrol. 14 7 602-605 2000

全著者名 論文名
Haruhiko Akiyama, Chisa Shukunami, Takashi Nakamura, and Yuji Hiraki Differential expressions of BMP family genes during chondrogenic differentiation of mouse ATDC5 cells
学術雑誌名 ページ 発行年
Cell Struct. Funct. 25 3 195-204 2000

全著者名 論文名
Itaru Yanagihara, Masayo Yamagata, Norio Sakai, Chisa Shukunami, Hiroki Kurahashi, Miwa Yamazaki, Toshimi Michigami, Yuji Hiraki and Keiichi Ozono Genomic organization of the human chondromodulin-1 gene containing a promoter region that confers the expression of reporter gene in chondrogenic ATDC5 cells
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Bone Miner. Res. 15 3 421-429 2000

全著者名 論文名
Chisa Shukunami, Haruhiko Akiyama, Takashi Nakamura, and Yuji Hiraki Requirement of autocrine signaling by bone morphogenetic protein-4 for chondrogenic differentiation of ATDC5 cells
学術雑誌名 ページ 発行年
FEBS Lett. 469 1 83-87 2000

全著者名 論文名
Mikio Furuse, Hiroyuki Sasaki, and Shoichiro Tsukita Manner of interaction of heterogenous claudin species within and between tight junction strands
学術雑誌名 ページ 発行年
J.Cell Biol. 147 4 891-903 1999

全著者名 論文名
Tadashi Hayami, Chisa Shukunami, Kaori Mitsui, Naoto Endo, Kunihiko Tokunaga, Jun Kondo, Hideaki E. Takahashi, and Yuji Hiraki Specific loss of chondromodulin-I gene expression in chondrosarcoma and the suppression of tumor angiogenesis and growth by its recombinant protein in vivo
学術雑誌名 ページ 発行年
FEBS Lett. 458 3 436-440 1999

全著者名 論文名
Chisa Shukunami, Saori Yamamoto, Tadashi Tanabe, and Yuji Hiraki Generation of multiple transcripts from the chicken chondromodulin-I gene and their expression during embryonic development
学術雑誌名 ページ 発行年
FEBS Lett. 456 1 165-170 1999

全著者名 論文名
Yuji Hiraki, Kaori Mitsui, Naoto Endo, Kazuhiro Takahashi, Tadashi Hayami, Hiroyuki Inoue, Kunihiko Tokunaga, Chisa Shukunami, Takaharu Kono, Mitunori Yamada, Hideaki Takahashi, and Jun Kondo Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells
学術雑誌名 ページ 発行年
Eur. J. Biochem. 260 3 869-878 1999

全著者名 論文名
Chisa Shukunami, Ken-ichi Iyama, Hiroyuki Inoue, and Yuji Hiraki Spatiotemporal pattern of the mouse chondromodulin-I gene expression and its regulatory role in vascular invasion into cartilage during endochondral bone formation
学術雑誌名 ページ 発行年
Int. J. Dev. Biol. 43 1 39-49 1999

B.国際会議発表論文(International Conferences)
全著者名 論文名
Yuriko Nishizaki, Chisa Shukunami, Yuji Hiraki Medaka (Oryzias latipes) Chondromodulin-I, a cartilage-derived angiogenesis inhibitor, is expressed in the notochord and otic placode
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
Developmental Vascular Biology Workshop Pacific Grove,Endothelium 10 350-351 2003

全著者名 論文名
Yusuke Oshima, Yuji Hiraki, Yasuo Tano, Chisa Shukunami Anti-angiogeneic action of a chondromodulin-I like domain of tenomodulin that is expressed in hypovascular dense connective tissues
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
Developmental Vascular Biology Workshop Pacific Grove,Endothelium 10 350-351 2003


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