平成１５年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業研究成果報告書概要


研究推進分野名 　 昆虫特異機能の発現機構と開発
　
研究プロジェクト名 　 昆虫の環境応答機構の解明と制御
　
（英文名） 　 Mechanisms and Regulation of Bioresponses of Insects to Environment
　
研究期間 　 平成１１年度〜平成１５年度

プロジェクト・リーダー名 研究経費 総額　 ３２９，０００千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名		 眞山　滋志・神戸大学
農学部・教授 		内訳 平成１１年度 ６８，０００千円
平成１２年度 ６５，０００千円
平成１３年度 ７０，０００千円
平成１４年度 ６３，０００千円
平成１５年度 ６３，０００千円

１．研究組織

氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
竹田真木生 神戸大学・大学院自然科学研究科・教授 プロジェクトリーダー代行・コアメンバー（物理環境応答）
土佐　幸雄 神戸大学・大学院自然科学研究科・助教授 研究協力者（生物環境応答）
濱西　　洋 神戸大学・農学部・助手 研究協力者（生物環境応答）
豊田　秀吉 近畿大学・農学部・教授 研究協力者（生物環境応答）
松田　克礼 近畿大学・農学部・助教授 研究協力者（生物環境応答）
野々村照雄 近畿大学・農学部・助手 研究協力者（生物環境応答）
藤原　義博 神戸大学・大学院自然科学研究科・助手 研究協力者（物理環境応答）

２．研究計画の概要

　本研究では、昆虫、とくに農業害虫の物理的・生物的環境要因に対する認識・応答機構の解明、ならびにそれらに基づく新規昆虫制御法の開発を試みた。
物理環境応答においては、昆虫の生活史を調節する光周性の機構を分子的なレベルで解決することを目指した。しかし、光周性は複雑な機構で直接調節遺伝子の突然変異に切り込めない。しかし、光周性の調節機構の重要な構成部分にかかわると考えられる概日時計の分子機構は、最近徐々に解明されてきた。そこで本研究は、概日時計の分子機構にかかわる因子の挙動を光周期の影響下で明らかにするというアプローチをとった。
　一方、生物環境応答の解析においては、ニジュウヤホシテントウを材料とし、その植物・微生物環境応答の解析を行った。まず、ニジュウヤホシテントウの寄主特異性の決定機構を特に植物誘導抵抗性の役割に焦点を当てて解析した。つぎに、微生物を利用したニジュウヤホシテントウの生物防除法の開発を試みた。

３．研究目的

1) 1: 大型で、生命力の強いゴキブリとコオロギをひとつのモデル系として、行動の記録と、生化学的なマーカー、遺伝学的なマーカーの挙動を対応付けようとした。これらは手術に耐え、長期的な行動記録をとることが可能であり、卵も大型で外来の遺伝子及びそれに類するものを注射したりするのに都合がよい。2: ゲノム・プロジェクトからの知見が利用できるカイコを台のモデル系とした。光周期の影響が調べられる。3: サクサンも光周性に対する基礎的な知識の蓄積された材料である。内分泌的な調節機構との接点が多い。これらのモデル系を用いて、概日時計の神経内分泌的な組み立てを明らかにし、それら因子及び転写産物の動態から測時機構の構造を探ろうとした。
2) 植物根内生細菌が、植物にニジュウヤホシテントウに対する抵抗性を誘導するか否かを検討する。誘導が起こる場合には、その抵抗性誘導機構を明らかにする。さらに、上記内生細菌により高い抵抗性誘導能を付与し、これを用いた食葉性害虫防除法の確立を試みる。
3) 植物葉面生息性細菌を分離し、これにキチン分解能力を付与し、これを用いてニジュウヤホシテントウ中腸ペリトロフィック膜をターゲットとした生物防除法の確立を試みる。さらに、植物葉面生息性を持つ昆虫病原細菌を探索・単離し、これを用いた安定・持続的な食葉性害虫生物防除法の確立を試みる。

４．研究成果の概要

４−１　研究計画、目的に対する成果
1) これまでの探索の結果、昆虫の概日時計の構造には、本質的なレベルにおいてもかなり、種レベルの違いが見られること、時計の出力にインドールアミン代謝系がかかわること、インドールアミン代謝系を中心に、光周性の構造的な機構がやや明らかになってきたことなどの新展開があった。いくつかの点を確かめるために計画された、突然変異体の作出とRNAiなどの計画は未達成となった。この計画は、人材の配置やカブラハバチの大量飼育計画がうまく回らなかったことによる。今後、突然変異株の固定には遜色があるが、光周性があり、行動の長期的なモニターが可能なコオロギを用いて克服する。
2) 内生細菌をトマト根に内生させ、ニジュウヤホシテントウを放虫して摂食行動の観察、摂食面積の計測を行ったが、内生の効果は認められなかった。トマトに抵抗性を誘導することが明らかになっているシステミンを処理しても結果は同様であった。このことから、ニジュウヤホシテントウはトマトの誘導抵抗性に完全に適応していると考えた。
3) キチン高分解能を持つ葉面細菌およびキチナーゼで形質転換した葉面細菌をアルギン酸ビーズに包埋してトマト葉に処理すると、ニジュウヤホシテントウによる食害を効率的に抑制できることが明らかとなった。さらに、新規の昆虫病原性細菌の分離に成功した。本細菌は、ニジュウヤホシテントウのみならずハスモンヨトウ、シルバーリーフコナジラミ、ミカンキイロアザミウマ、トマトハモグリバエの成虫及び幼虫に対して効果的であることが明らかとなり、生物防除資材として有望であると結論した。


４−２　研究計画、目的外の成果
　上記１）において、NATは時計以外にも多くの生理機能を調節する酵素である。今回のクローニングの成功により、それら生理機能の解明にも寄与することができるだろう。チームのこれ以外の研究重点は中腸の細胞増殖機能の制御と、生殖調節であるが、NATは両者に深くかかわっている。NATをターゲットにした、ある殺虫剤会社との共同研究がスタートした。
上記３）において、Specialist herbivorであるニジュウヤホシテントウは宿主トマトの誘導抵抗性に完全に適応していることが明らかとなったが、一方で非宿主であるアブラナ科植物の誘導抵抗性は乗り越えることができないことが判明した。さまざまな植物上における摂食行動の観察結果も総合した結果、ニジュウヤホシテントウの寄主範囲の決定には３つのステップすなわち寄主植物の認識、静的抵抗性の打破、ならびに誘導抵抗性の打破が関わっていると考えた。そして、ニジュウヤホシテントウはこれら３つのステップを全て通過することができた場合のみその植物を寄主とすることができるのであり、誘導抵抗性はSpecialistの適応を阻害する最後のバリヤーであると考えた。

４−３　研究成果の展望
物理環境応答）
　生物時計の機構がハエと人で保存されているという事実は生物学界に大きなインパクトを与えた。しかし、それらと共通の遺伝子オーソログは見つかっているが、それらの繰り広げるエピソードは種によってかなり違う。今回の研究により、いくつかの教科書的な記載が覆った。また、全くアプローチを許さなかった光周性機構の解明の端緒が開かれた。
生物環境応答）
　これまでになかった新しい視点からの新領域を開拓したと考える。これまで、植食性害虫の寄主特異性は、植物の保有する物質を昆虫がいかに認識するかという視点からのみ論じられてきた。本研究では、昆虫と植物の相互作用の段階を概念的に３つのステップに分割・整理し、そのなかで誘導抵抗性が果たす役割の重要性を指摘した。今後このような視点からさまざまな昆虫-植物相互作用が解析されれば、昆虫と植物が織りなす複雑な特異性の全体像を総合的に鳥瞰することが可能となるであろう。また、本研究で考案された微生物を用いた食葉性害虫の生物防除法は、現場への応用に発展する可能性を秘めている。さらなる改良が期待される。


４−４　本事業の趣旨に鑑み、果たした役割
物理環境応答）
　遺伝学的に優れたキイロショウジョウバエにおける研究成果が、生理学や細胞学的な研究に適した大型昆虫の間の溝をこえて、ある程度繋がった。われわれは、おそらく、関連するかもしれない遺伝子産物の抗体の大きなストックを作り、それを用いていくつか異なる種の脳でこれら関連する可能性のある抗原のネットワークの比較をおこなった。また、これまで、ほとんど皮膚の形成の局面でしか議論されてこなかったNATの重要性を明らかにした。
生物環境応答）
　本事業の目的は昆虫特異機能の開発である。生物環境研究は、植食性昆虫が３段階からなる植物のブロック機構をかいくぐっていることを明らかにした。そのメカニズムを３ステップの相互関連のなかで明らかにすれば、その特異機能の逆利用により新規な害虫防除法が開発できると期待される。実際、微生物環境研究の成果は、昆虫の消化吸収に関与するミクロビリーの保護および病原性微生物に対する防御壁として機能している中腸ペリトロフィック膜が、害虫防除のためのターゲットとなりうることを示したものであり、上記のような昆虫特異機能の逆利用が成功した例であると考える。

５．キーワード

(1)概日時計 (2)光周性 (3)インドールアミン
(4)休眠 (5)ニジュウヤホシテントウ (6)寄主特異性
(7)誘導抵抗性 (8)キチナーゼ (9)ペリトロフィック膜

６．研究成果発表状況

A.学術雑誌論文（Journal Papers）
全著者名 論文名
M. Takeda, Y. Endo, H. Ohnishi, and N. Ichihara Photoperiodic system in physiological reality
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Entomological Science 2 4 567-574 1999

全著者名 論文名
H. Ohnishi, and M. Takeda Free amino acids in the cephalic ganglia of the American cockroach, Periplaneta americana and the daily fluctuations
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Jpn. J. Appl. Entomol. Zool. Chugoku Brunch 42 ??? 15-20 2000

全著者名 論文名
D. B. Sattelle, J. B. Harrison, H. H. Chen, D. Bai, and M. Takeda Immunocytochemical localization of putative -aminobutyric acid receptor subunits in the head ganglia of Periplaneta americana using an anti-RDL C-terminal antibody
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Neuroscience lett. 289 ??? 197-200 2000

全著者名 論文名
Y. Tohno, K-Z. Li, and M. Takeda Two types of diapause development in the Chinese oak silkmoth, Antheraea pernyi
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Int. J. Wild Silkmoth & Silk 5 ??? 31-39 2000

全著者名 論文名
N. Ishihara, M. Okada, and M. Takeda Purification of Polymorphic arylalkylamine N-acetyltransferase from the Anerican cockroach, Periplaneta americana
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Insect Biochem. Molec. Biol. 32 ??? 15-22 2001

全著者名 論文名
Y. Tohno, and M. Takeda Sex-specific circadian dynamics of cyclic nucleotides in the cerebral ganglia of an univoltine strain of Antheraea pernyi during post-diapause development
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Int. J. Wild Silkmoth & Silk 6 ??? 17-24 2001

全著者名 論文名
H. Yamano, Y. Watari, T. Arai, and M. Takeda Melatonin in drinking water influences a circadian rhythm of locomotor activity in the house cricket, Acheta domesticus
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Insect Physiol. 47 ??? 943-949 2001

全著者名 論文名
L. Zhang, Q. Yang, Y. Tosa, H. Nakayashiki, and S. Mayama Involvement of gacA gene in the suppression of tomato bacterial wilt by Pseudomonas fluorescens FPT9601
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Gen. Plant Pathol. 67 ??? 134-143 2001

全著者名 論文名
M. Matsumoto, and M. Takeda Changes in brain monoamine contents in diapause pupae of Antheraea pernyi when activated under long-day and by chilling
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Insect Physiol. 48 ??? 765-771 2002

全著者名 論文名
C. C. Niva, and M. Takeda Color changes in Halyomorpha brevis (Heteroptera: Pentatomidae) correlated with distribution of pteridines: regulation by environmental and physiological factors
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Comp. Biochem. Physiol. Part B 132 ??? 653-660 2002

全著者名 論文名
Y. Takikawa, H. Mori Y. Otsu, Y. Matsuda, T. nonomura, K. Kakutani, Y. Tosa, S. Mayama, and H. Toyoda Rapid detection of phylloplane bacterium Enterobacter cloacae based on chitinase gene transformation and lytic infection by specific bacteriophages
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Appl.. Microbiol 93 ??? 1042-1050 2002

全著者名 論文名
H. Asano, J. Bembenek, and M. Takeda Multiple forms arylalkylamine N-acetyltransferase (NAT) from cockroach female colleterial glands and activity changes during oocyte maturation
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Comp. Biochem. Physiol. Part A 134 ??? 795-803 2003

全著者名 論文名
Y. Iida, Y. Matsuda, R. Saito, M. Nakasato, T. Nonomura, K. Kakutani, Y. Tosa, S. Mayama, and H. Toyoda Efficient release of overproduced gene products from Escherichia coli BL21(DE3) by lytic infection with newly isolated bacteriophages
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Biosci. Biotechnol. Biochem. 67 ??? 198-202 2003

全著者名 論文名
E. P. Markova, H. Ueda, K. Sakamoto, K. Oishi, T. Shimada, and M. Takeda Cloning of Cyc (Bmal-1) homolog in Bombyx mori; Structural analyses and the tissue specific distributions
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Comp. Biochem. Physiol. Part B 134 ??? 535-542 2003

全著者名 論文名
C. C. Niva, and M. Takeda Effects of photoperiod temperature and malatonin on nymphal development, polyphenism and reproduction in Halymorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae)
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Zool. Sci. 20 ??? 963-970 2003

全著者名 論文名
Y. Otsu, Y. Matsuda, H. Shimizu, H. Ueki, H. Mori, K. Fujiwara, T. Nakajima, A. Miwa, T. Nonomura, Y. Sakuratani, Y. Tosa, S. Mayama, and H. Toyoda Biological control of phytophagous ladybird beetles Epilachna vigintioctopunctata (Coleoptera: Coccinellidae) by chitinolytic phylloplane bacteria Alcaligenes paradoxus entrapped in alginate Beads
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Appl. Entomol. 127 ??? 441-446 2003

全著者名 論文名
Y. Otsu, H. Mori, K. Komuta, H. Shimizu, S. Nogawa, Y. Matsuda, T. Nonomura, Y. Sakuratani, Y. Tosa, S. Mayama, and H. Toyoda Suppression of leaf feeding and oviposition of phytophagous ladybird beetles (Coleoptera: Coccinellidae) by chitinase gene-transformed phylloplane bacteria and their specific bacteriophages entrapped in alginate gel beads
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Econ. Entomol. 96 ??? 555-563 2003

全著者名 論文名
Y. Takikawa, Y. Ishii, K. Fujiwara, Y. Matsuda, T. Nonomura, K. Kakutani, Y. Tosa, S. Mayama, and H. Toyoda Rapid detection of chitosanase activity in chitosanase gene-transformed strain of Enterobacter cloacae by lytic infection of specific bacteriophages
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Gen. Plant Pathol. 69 ??? 131-137 2003

全著者名 論文名
S. Qi-Miao, S. Tanaka, and M. Takeda Immunohistochemical localization of clock proteins (DBT and PER), and [His7]- and [Arg7]-corazonins in the cerebral ganglia of Bombyx mori: Are corazonins downstream regulatoes od circadian clocks?
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Eur. J. Entomol. 100 ??? 283-286 2003

全著者名 論文名
E. P. Markova, T. Shimada, and M. Takeda Daily expression patterns of Cycle and Clock genes in the head of the silkworm, Bombyx mori
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biotech. Biotechnol. Equip. 18 1 77-81 2004

全著者名 論文名
Y. Otsu, Y. Matsuda, H. Mori, H. Ueki, T. Nakajima, K. Fujiwara, M. Matsumoto, N. Azuma, K. Kakutani, T. Nonomura, Y. Sakuratani, T. Shinogi, Y. Tosa, S. mayama, and H. Toyoda Stable phylloplane colonization by entomopathogenic bacterium Pseudomonas fluorescens KPM-018P and biological control of phytophagous ladybird beetles Epilachna vigintioctopunctata
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Biocon. Sci. Technol ??? ??? ??? 2004(in press)

全著者名 論文名
J. Bembenek, N. Ichihara, and M. Takeda Day/night fluctuations in melatonin content, arylalkylamine N-acetyltransferase activity and NAT mRNA expression in the CNS, peripheral tissues and hemolymph of the cockroach, Periplaneta americana
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Comp. Biochem. Physiol. Part A 134 ??? 795-803 2004(in press)

全著者名 論文名
T. Shinogi, Y. Hamanishi, Y. Q. Wang, Y. Otsu, Y. Tosa, Y. Narusaka, T. Nonomura, Y. Matsuda, H. Toyoda, and S. Mayama. Role of induced resistance in interaction between Epilachna vigintioctopunctata and host/nonhost plants
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Planta ??? ??? ??? 2004 (in press)

C.著書（Books）
全著者名 書名
竹田真木生 環境昆虫学（日高敏隆・松本義明監修、本田計一・本田洋・田付貞洋編）
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
東京大学出版会 東京 ISBN4-13-060205-5 27-42 1999

全著者名 書名
M. Takeda Enviromental Entomology (Editor: K. Honda, H. Honda, and S. Tatuki)
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
Tokyo university Pub. Tokyo ISBN4-13-060205-5 27-42 1999

全著者名 書名
H. Toyoda, Y. Matsuda, T. Nonomura, Y. Takikawa, Y. Otsu, H. Mori, and K. Kakutani Chitin Enzymology 2001. (Editor: R. A. A. Muzzarelli)
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
Atec Ancona ISBN88-86889-06-2 179-184 2001

全著者名 書名
竹田真木生 昆虫学大事典（三橋淳他編）
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
朝倉書店 東京 ISBN4-254-42024-2 295-303 2003

全著者名 書名
M. Takeda Encyclopedia of Entomology (Editor: J. Mitsuhashi)
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
Asakura-shoten Tokyo ISBN4-254-42024-2 295-303 2003

全著者名 書名
竹田真木生 休眠の昆虫学―季節適応の謎 (田中誠二・檜垣守男・小滝豊美編著)
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
東海大学出版会 神奈川 ISBN4-486-01642-4 235-246 2004

全著者名 書名
M. Takeda Science of Insect Dormancy (Editor: S. Tanaka, M. Higaki, and T. Kotaki)
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
Tokai university Pub. Kanagawa ISBN4-486-01642-4 235-246 2004

D.特許等取得状況
特許等名称 発明者名
キチン質分解酵素を遺伝子標識に利用した細菌モニタリング法 眞山滋志・土佐幸雄・大津康成・豊田秀吉・桜谷保之・松田克礼・野々村照雄・瀧川義浩・森裕文
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
神戸大学長 発明 平成14年特許願第260418号 平成14年９月５日 ???

特許等名称 発明者名
食葉性害虫に対し抑制効果を有する細菌を内包したアルギン酸マイクロビーズによる害虫駆除の方法 眞山滋志・土佐幸雄・大津康成・豊田秀吉・桜谷保之・松田克礼・野々村照雄・瀧川義浩・森裕文
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
神戸大学長 ??? 平成14年特許願第260419号 平成14年９月５日 ???

特許等名称 発明者名
昆虫病原性細菌シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens） KPM-018Pを利用した植物害虫防除剤および植物害虫防除方法 眞山滋志・土佐幸雄・大津康成・豊田秀吉・松田克礼・野々村照雄
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
神戸大学 ??? 平成15年特許願第336082号 平15年9月26日 ???

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