平成15年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業研究成果報告書概要



研究推進分野名   昆虫特異機能の発現機構と開発
 
研究プロジェクト名   吸血刺咬昆虫の生理活性分子の探索と作用機構の解析
 
(英文名)   Identification, Activity and Mode of Action of Bio-active Molecules from Blood-Sucking and Stinging Insects
 
研究期間   平成11年度〜平成15年度

プロジェクト・リーダー名 研究経費 総額 374,297千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名
鎮西 康雄・三重大学
医学部・教授
内訳 平成11年度 70,116千円
平成12年度 63,000千円
平成13年度 70,181千円
平成14年度 89,000千円
平成15年度 82,000千円

1.研究組織

氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
油田 正夫 三重大学・医学部・助手 ハマダラカによるマラリア媒介機構
伊澤 晴彦 国立感染症研究所・昆虫医科学部・研究員 唾液腺生理活性分子の探索と機能解析
岩永 史朗 神戸大学・農学部・助手 唾液腺生理活性分子の探索と機能解析
石野 智子 科学技術振興機構・研究員 ハマダラカによるマラリア媒介機構
大船 泰史 大阪市立大学・大学院理学研究科・教授 刺咬昆虫毒線分子の合成
品田 哲郎 大阪市立大学・大学院理学研究科・講師 刺咬昆虫毒線活性分子の活性特性
直木 秀夫 財・サントリー生物有機科学研究所・研究員 刺咬昆虫毒線成分の分析

2.研究計画の概要

このプロジェクトは3つの研究計画からなる。それぞれの計画概要は以下の通りである。
(1) 吸血昆虫唾液腺の生理活性分子の探索と作用機構の解明
 各種吸血昆虫はその唾液腺に宿主動物の血液や血管を制御しながら吸血を助ける活性分子を持つことが知られている。これらの活性分子を探索同定し、機能を解析することによって、血液や血管を制御する医薬品のリード分子として開発できる可能性を秘めている。そこで、ハマダラカ・ブラジルサシガメ・フタトゲチマダニを材料として、EST data base 解析を行い、その中から一定の基準によって選定した遺伝子のタンパク質を発現し、機能解析を行った。
(2) ハマダラカによるマラリア原虫媒介機構の解明
 マラリア原虫はハマダラカが媒介する。その特異性を明らかにすること、媒介の条件となる宿主細胞への接着や侵入(感染)に必須の分子を原虫側・宿主媒介蚊側双方から明らかにするため、原虫の宿主細胞への感染ステージのEST data base 解析を行った。この中から選定した遺伝子に注目し、発現された分子の局在を明らかにし、遺伝子ノックアウトした原虫を作製しその表現型を解析することで、この遺伝子機能を解析した。
(3) 刺咬昆虫の麻痺性神経毒の単離・構造・合成・作用機構の解析
 昆虫の刺咬毒には脊椎動物や無脊椎動物など広範に亘って神経麻痺作用を示す低分子成分の存在が知られている。それらの内、特異な化学構造、あるいは作用機序を持つ化合物の探索、単離、構造の解析を行い、その活性特性を検討した。特異活性成分の化学合成と構造活性相関研究により、有効な活性分子を設計・合成し、神経機能解明のための手段物質や医薬・農薬のリード物質の開発を行った。

3.研究目的

3つの研究のそれぞれの目的を述べる。
(1) 血昆虫唾液腺の生理活性分子の探索と作用機構の解明
 1)吸血昆虫・ダニの唾液腺に含まれる血管や血液に特異な活性を持つ分子を探索する。
 2)それらの活性特性・作用機構を明らかにする。
 3)それらの分子を医薬品・農薬・試薬としてのリード分子として開発する。
(2) ハマダラカによるマラリア原虫媒介機構の解明
 1)マラリア原虫の媒介蚊ハマダラカへの感染に関わる分子を同定し機能を解析する。
 2)ハマダラカの吸血による感染の成立に関わる分子を同定し、媒介機構を解明する。
(3)刺咬昆虫の麻痺性神経毒の単離・構造・合成・作用機構の解析
 1)高感度分析法の開発をもとに、毒腺に含まれる神経麻痺活性など特異な作用機序を持つ化合物を解析する。
 2)麻痺性神経毒をリードとした新規生理活性分子を設計・合成し、神経科学研究の手段物質や医薬・農薬のリード物質を開発する。

4.研究成果の概要

4−1 研究計画、目的に対する成果
(1)昆虫唾液腺の生理活性分子の探索と作用機構の解明
 1) 血小板凝集阻害活性分子を、ブラジルサシガメから2分子 (triplatin1,2) 同定し機能を解析した。2)接触相活性化阻害分子を、ブラジルサシガメから2分子(sasigamin1,2)、ハマダラカから2分子(hamadarin1,2)、フタトゲチマダニから1分子(haemophysalin)同定し機能を解析した。3)抗凝固活性分子を、ブラジルさしガメから1分子(triatin)、ハマダラカから1分子(stephensin)、フタトゲチマダニから2分子(madanin1,2)同定し機能を解析した。
(2)ハマダラカによるマラリア原虫媒介機構の解明
 1)マラリア原虫オオキネートが中腸細胞への侵入や移動に関わる分子を4分子(CTRP, OSM1, MACok, WARP)同定し、それぞれの機能を解析した。2)中腸スポロゾイトが唾液腺への接着侵入に必須の分子を1分子(MAEBL)同定し、細胞内局在や機能を解析した。3)唾液腺スポロゾイトが動物肝細胞への感染に関わる必須の分子を3分子(SPECT, OSM1, MAC)同定し機能解析を行った。4)赤外型原虫(肝臓型原虫)の肝細胞内での増殖に関わって必須と考えられる分子を1分子(VASP1)同定し機能解析した。
(3)刺咬昆虫の麻痺性神経毒の単離・構造・合成・作用機構の解析
 1) 各種MS法によるハチ、サソリ、サシガメの神経麻痺性ペプチド類の単離・構造・活性特性を解析した。
 2) 高分解能MSとLCの組み合わせによるハチ毒アミン類のデータベースを構築し新規アミン類を量産した。
 3) 各種分析法によるアナバチ類の毒液の全成分解析を行い、複合分子作用による持続性麻痺活性特性を解明した。
 4) ブチリルコリンをはじめとする各種新規コリン類縁体を化学合成し構造確認と量産を行った。
 5) スクアリン酸(四角酸)を用いた高活性ポリアミン毒を合成し、MS標識分子としての活用法も開発した。


4−2 研究計画、目的外の成果
(1)昆虫唾液腺の生理活性分子の探索と作用機構の解明
 特に研究計画・目的外の成果はない。
(2)ハマダラカによるマラリア原虫媒介機構の解明
 特に研究計画・目的外の成果はない。
(3)刺咬昆虫の麻痺性神経毒の単離・構造・合成・作用機構の解析
 特に研究計画・目的外の成果はない。


4−3 研究成果の展望
(1)昆虫唾液腺の生理活性分子の探索と作用機構の解明
 網羅的な活性分子の探索という目的を達成するために、EST解析・発現・機能解析による解析方法が大変有効であることが示された。今後の同様の研究に一定の指針となる成果であった。
(2)ハマダラカによるマラリア原虫媒介機構の解明
 マラリア原虫のゲノム解析が終了し、次の課題はここの遺伝子の発現と昨日の解析である。我々の研究は各ステージでのEST解析と遺伝子ノックアウト原虫の表現型解析を調べることで、多くの遺伝子の機能を明らかにすることができた。今後の研究のあり方を示すものとなった。
(3)刺咬昆虫の麻痺性神経毒の単離・構造・合成・作用機構の解析
 超微量生理活性物質の単離・構造解析を行うために、各種高感度分析法の相補的な活用が有用であることが示された。アナバチ毒液成分の解析法を例として、他のカリバチによる持続性麻痺の全容の解明に一般的な方法を与える成果であった。また、麻痺性神経毒をリードとした新規生理活性分子が開発できた。神経科学研究の手段物質として昆虫麻痺を引き起こす低分子毒への関心が高まる成果となった。


4−4 本事業の趣旨に鑑み、果たした役割
(1)昆虫唾液腺の生理活性分子の探索と作用機構の解明
 吸血昆虫唾液腺活性分子の吸血における役割とそれらの宿主血液血管の生理機能への見事な適応が明らかになり、生物のダイナミックな進化と吸血昆虫の生き様を示すことができた。活性分子については生理機能が明らかであり、医薬その他有用な薬品開発の素材となりうるものである。
(2)ハマダラカによるマラリア原虫媒介機構の解明
 マラリア原虫の生活環の中で解析が遅れていた媒介蚊の中のステージと特に肝臓への感染のステージでの感染増殖の分子基盤の全貌解明に貢献できる。これらの感染の機構の解明を背景とした感染阻止手段の開発技術に繋がる成果が上げられた。
(3)刺咬昆虫の麻痺性神経毒の単離・構造・合成・作用機構の解析
 刺咬昆虫の毒腺成分の解析により、刺咬における神経麻痺が多くの小分子成分によるものであることが実証された。例えば、ファーブルの昆虫記に記載されていたカリバチの麻痺毒の謎を、アナバチを例として明らかにできた。これらの研究は、超微量成分の解析における高感度分析法と構造確認・量産・誘導化における化学合成の密接な連携で行われ、学際共同研究の実をあげることができた。

5.キーワード

(1)吸血昆虫 (2)唾液腺 (3)EST 解析
(4)生理活性分子 (5)マラリア原虫 (6)ハマダラカ
(7)刺咬昆虫 (8)持続性神経麻痺毒 (9)高感度分析法

6.研究成果発表状況

A.学術雑誌論文(Journal Papers)
 (1) 昆虫唾液腺の生理活性分子の探索と作用機構の解明
全著者名 論文名
Shiroh Iwanaga, Masakazu Okada, Haruhiko Isawa, Akihiro Morita, Masao yuda, and Yasuo Chinzei Identification and characterization of novel salivary gland thrombininhibitors from the ixodidae tick, Haemaphysalis longicornis 
学術雑誌名 ページ 発行年
 Eur. J. Biochem. 270 ??? 1926-1934 2003

全著者名 論文名
Haruhiko Isawa, Masao Yuda, Yuki Orito and Yasuo Chinzei A Mosquito salivary protein inhibits activation of the plasma contact system by binding to factor XII and high molecular weight kininogen.
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 277 31 27651-27658. 2002

全著者名 論文名
Yasuo Chinzei Function of bioactive substances in the salivary glands from blood sucking insects. 
学術雑誌名 ページ 発行年
Med. Entomol. Zool. 51 1 1-11 2000

全著者名 論文名
Haruhiko Isawa, MasaoYuda, Kentaro Yoneda and Yasuo Chinzei The insect salivary protein, prolixin-S, inhibits factor IXa generation and Xase complex formation in the blood coagulation pathway.
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 275 9 6636-6641. 2000

全著者名 論文名
Yuji Kaneko, Masao Yuda, Takayoshi Iio, Tomohiko Murase and Yasuo Chinzei Kinetic analysis on nitric oxide binding of recombinant Prolixin-S, a nitric oxide transport protein from the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus.
学術雑誌名 ページ 発行年
Biochemica et Biophysica Acta. 1431 ??? 492-499 1999

全著者名 論文名
Jianxin Sun, Philomene Waidhet-Kouadio, Katsuhiko Ando and Yasuo Chinzei Changes in salivary gland proteins during blood feeding in Rhodnius prolixus, and dynamics of antibodies specific to salivary antigens in rabbits bitten by the bugs.
学術雑誌名 ページ 発行年
Med. Entomol. Zool. 50 1 41-50 1999

全著者名 論文名
Yuji Kaneko, Hideki Shojo, Masao Yuda and Yasuo Chinzei Effects of recombinant nitrophorin-2 nitric oxide comples on vascular smooth muscle.
学術雑誌名 ページ 発行年
Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 8 1488-1490. 1999

 (2) ハマダラカによるマラリア原虫媒介機構の解明
全著者名 論文名
Tomoko Ishino, Kazuhiko Yano, Yasuo Chinzei and Masao Yuda Cell passage activity is required for the malarial parasite to cross the liver sinusoidal cell layer
学術雑誌名 ページ 発行年
PLoS Biology 2 ??? 77-84 2004

全著者名 論文名
Toru Kariu, Masao Yuda, Kazuhiko Yano and Yasuo Chinzei MAEBL is essential for malarial sporozoite infection of the mosquito salivary gland
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Exp. Med. 195 10 1317-1323 2002

全著者名 論文名
Wutipong Limviroj, Kazuhiko Yano, Masao Yuda, Katsuhiko Ando and Yasuo Chinzei Immuno-electron microscopic observation of Plasmodium berghei CTRP localization in the midgut of vector mosquito Anopheles stephensi
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Parasitol. 88 4 664-672 2002

全著者名 論文名
Masao Yuda, Kazuhiko Yano, Takafumi Tsuboi, Motomi Torii and Yasuo Chinzei von Willebrand Factor A domain-related protein, a novel microneme protein of the malaria ookinete highly conserved throughout Plasmodium parasites
学術雑誌名 ページ 発行年
Mol. Biochem. Partasitol 116 ??? 65-72 2001

全著者名 論文名
Masao Yuda, Toshiki Sawai and Yasuo Chinzei Structure and expression of an adhesive protein-like molecule of mosquito invasive-stage malarial parasite.
学術雑誌名 ページ 発行年
J . Exp. Med. 189 12 1947-1952 1999

全著者名 論文名
Masao Yuda, Hiroshi Sakaida and Yasuo Chinzei Targeted disruption of the Plasmodium berghei CTRP gene reveals its essential role in malaria infection of the vector mosquito.
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Exp. Med. 190 11 1711-1715 1999

 (3) 刺咬昆虫の麻痺性神経毒の単離・構造・合成・作用機構の解析

全著者名 論文名
Tetsuro Shinada, Yoshito Nakagawa, Ken-ichi Hayashi, Gerardo Corzo, Terumi Nakajima, and Yasufumi Ohfune Syntheses and Paralytic Activities of Squaryl Amino Acid-Containing Polyamine Toxins
学術雑誌名 ページ 発行年
Amino Acids 24 ??? 293-301 2003

全著者名 論文名
Li Dai, Gerardo Corzo, Hideo Naoki, Marta Andriantsiferana, and Terumi Nakajima Purification, structure-function analysis, and molecular characterization of novel linear peptides from scorpion Opisthacanthus madagascariensis
学術雑誌名 ページ 発行年
Biochem Biophys Res. Commun. 293 ??? 1514-1522  2002

全著者名 論文名
Li Dai, Akikazu Yasuda, Hideo Naoki, Gerardo Corzo, Marta Andriantsiferana, and Terumi Nakajima IsCT. A novel Cytotoxic Linear Peptide from Scorpion Opisthacanthus madagascariensis
学術雑誌名 ページ 発行年
Biochem. Biophys. Res. Commun. 286 4 820-825 2001

全著者名 論文名
Keiko Shimamoto, Yasushi Shigeri, Yoshimi Yasuda-Kamatani, Bruno Lebrun, Noboru Yumoto, and Terumi Nakajima Syntheses of optically pure -hydroxyaspartate derivatives as glutamate transporter blockers
学術雑誌名 ページ 発行年
Bioorg. Med. Chem. Lett. 10 ??? 2407-2410 2000

B.国際会議発表論文(International Conferences)
 (1) 昆虫唾液腺の生理活性分子の探索と作用機構の解明
全著者名 論文名
Yasuo Chinzei Bioactive molecules from the salivary glands of blood sucking insects and tick.
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
International Symposium on the expression mechanisms of insect functions Tokyo ??? ??? 2003

全著者名 論文名
Shiro Iwanaga, Noriko Kato, Haruhiko Isawa,Masao Yuda and Yasuo Chinzei Identification and characterization of novel anticoagulants from thehard ick, Haemophysalis longicornis
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
International Symposium on the expression mechanisms of insect functions Tokyo ??? ??? 2003

全著者名 論文名
Yasuo Chinzei Multifunctional bioactive molecules, Prolixin-S, from the blood sucking bug, Rhodnius prolixus
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
The International Meeting on Research for the Future Program Osaka ??? ??? 2001

全著者名 論文名
Haruhiko Isawa Isolation and characterization of an inhibitor of the plasma contact system from mosquito saliva
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
The International Meeting on Research for the Future Program Osaka ??? ??? 2001

全著者名 論文名
Shiro Iwanaga Identification and characterization of novel anticoagulants from the salivary glands of the hard tick, Haemophysalis longicornis,
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
The International Meeting on Research for the Future Program Osaka ??? ??? 2001

 (2) ハマダラカによるマラリア原虫媒介機構の解明

全著者名 論文名
Masao Yuda Infection mechanisms of mosquito stage malarial parasite;essential function of CTRP for midgut infection
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
The International Meeting on Research for the Future Program Osaka ??? ??? 2001

全著者名 論文名
Tohru Kariu Essential function of MAEBL for malarial infection of tne mosquito salivary glands
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
The International Meeting on Research for the Future Program Osaka ??? ??? 2001

全著者名 論文名
Tomoko Ishino cDNA cloning of a novel TRAP-family protein and its involvement in the malarial parasite transmission to the vertebrate liver
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
The International Meeting on Research for the Future Program Osaka ??? ??? 2001

全著者名 論文名
Kazuhiko Yano, Tohru Kariu, Masao Yuda and Yasuo Chinzei Electron-microscopic examination of malarial ookinete invasion route into the mosquito midgut
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
The International Meeting on Research for the Future Program Osaka ??? ??? 2001

全著者名 論文名
Masao Yuda, Tohru Kariiu, Tomoko Ishino, Kazuhiko Yano and Yasuo Chinzei Malarial micronemal protein playing a critical roll on both mosquito and vertebrate invasive stages
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
??? ??? ??? ??? ???

 (3)刺咬昆虫の麻痺性神経毒の単離・構造・合成・作用機構の解析
全著者名 論文名
Kazuya Murata, Tetsuro Shinada, Yasufumi Ohfune, Miki Hisada, Hideo Naoki, Terumi Nakajima Analysis of Amine Components in the Venom of Solitary Wasps by LC/HRMS
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
International Symposium on Toxins and Natural Products in Honor of Professor Anthony T. Tu Okinanawa abstract 47 2002

全著者名 論文名
Yasufumi Ohfune, Tadashi Demura, Masanori Kawasaki, Tetsuro Shinada Asymmetric Synthesis of -Substituted Glutamate Analogs(invited)
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
The 7th International Congress on Amino Acids and Proteins Vienna Abstract 72 2001

全著者名 論文名
Tetsuro Shinada, Ken-ichi Hayashi, Yasufumi Ohfune Efficient Syntheses of a Novel Glutamate Analog Possesing 4-Hydroxy-2,3-dioxocyclobut-1-enyl Group Squaryl Group
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
2000 International Chemical Congress of Pacific Basin Society Hilton Hawaian Village, Honolulu Abstract Part 1 8-MEDI 255 2000

D.特許等取得状況
特許等名称 発明者名
血小板凝集阻害活性を有するブラジルサシガメ由来のTi-3蛋白質 森田明広、伊澤晴彦、油田正夫、鎮西康雄、織戸由貴
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2002-289683 平成14年10月2日 ???

特許等名称 発明者名
血小板凝集阻害活性を有するブラジルサシガメ由来のTi-4蛋白質 森田明広、伊澤晴彦、油田正夫、鎮西康雄、織戸由貴
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2002-289564 平成14年10月2日 ???

特許等名称 発明者名
血液凝固阻害活性を有するブラジルサシガメ由来のTi-1蛋白質 鎮西康雄、油田正夫、伊澤晴彦
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2001-316835 平成13年10月15日 ???

特許等名称 発明者名
血液凝固阻害活性を有するブラジルサシガメ由来のTi-2蛋白質 鎮西康雄、油田正夫、伊澤晴彦
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2001-317370 平成13年10月15日 ???

特許等名称 発明者名
血液凝固阻害活性を有するハマダラカ由来のAs-1蛋白質 鎮西康雄、油田正夫、伊澤晴彦
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2001-317330 平成13年10月15日 ???

特許等名称 発明者名
ブラジキニン産生阻害活性及び血液凝固阻害活性を有するハマダラカ由来のAs-2蛋白質 鎮西康雄、油田正夫、伊澤晴彦
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2001-317257 平成13年10月15日 ???

特許等名称 発明者名
血液凝固阻害活性を有するフタトゲチマダニ由来のHl-1蛋白質 鎮西康雄、油田正夫、伊澤晴彦、岩永史朗
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2001-317325 平成13年10月15日 ???

特許等名称 発明者名
血液凝固阻害活性を有するフタトゲチマダニ由来のHl-2蛋白質 鎮西康雄、油田正夫、伊澤晴彦、岩永史朗
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2001-317155 平成13年10月15日 ???

特許等名称 発明者名
血液凝固阻害活性を有するフタトゲチマダニ由来のHl-3蛋白質 鎮西康雄、油田正夫、伊澤晴彦、岩永史朗
権利者名 種類 出願番号 出願年月日 設定登録年月日
矢谷隆一大学長 発明 特願2001-317156 平成13年10月15日 ???


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