平成14年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業研究成果報告書概要



研究推進分野名   成人病-遺伝素因と環境因子の解明
 
研究プロジェクト名   生体系を用いた心・腎疾患の進行機序の解明
 
(英文名)   In Vivo Molecular Studies on Cardio-renal Remodeling
 
研究期間   平成10年度〜平成14年度

プロジェクト・リーダー名 研究経費 総額  324,627千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名
市川家國・東海大学
医学部・教授
内訳 平成10年度 74,708千円
平成11年度 79,919千円
平成12年度 50,000千円
平成13年度 60,000千円
平成14年度 60,000千円

1.研究組織

氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
松阪 泰二 東海大学・総合医学研究所・講師 キメラマウスの作製と解析、新たな腎炎モデルの作製と解析、レニン転写制御の研究
新村 文男 東海大学・医学部・講師 アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン受容体の細胞特異的ノックアウトマウスの作製(平成12年4月1日から)
宮崎 陽一 東京慈恵会医科大学・腎高血圧科・助手 レニン・アンジオテンシン系分子変異マウスの解析

2.研究計画の概要

 循環器疾患、および慢性腎疾患の進展機序の解明を、試験管内の実験ではなく、生体を用いた系で明らかにすることを目的として、種々の動物実験系を作り上げ、その解析を行う。
 多くの循環器・腎疾患において、アンジオテンシンの阻害が、その降圧効果と独立して臓器保護効果を示すので、我々は、まず、アンジオテンシンの作用モードを全身的なものと局所的なものとに分離して検討することに主眼を置いた。このため、胚集合法や骨髄移植を用いてキメラマウスを作製したり、Cre-loxPシステムを利用して細胞特異的に遺伝子を不活化したマウスを作製して、体の一部のみでアンジオテンシンが作用したり、産生したりする状況を作り出す。これらのマウスを用いて、アンジオテンシン持続静注や、ハブ毒投与、尿管結紮、摂取塩分量の制限など、種々の状況における生体の変化、とくに心臓、血管系、腎臓の病変を観察する。
 上記の計画と並行して、新たな腎炎モデルを開発する。慢性腎不全進行の主たる病態である糸球体硬化の機序を、上記のようなモデルマウスを用いて解明するためには、マウスにおいて再現性よく糸球体硬化が誘導できるモデルが必須である。糸球体上皮細胞傷害を細胞特異的に、かつ任意のタイミングで誘導するユニークなモデルを、遺伝子操作により独自に開発し、そのモデルを用いて、糸球体硬化の機序解明に積極的に取り組む。
 最終的には、上述した種々の生体系における解析から、循環器疾患、腎疾患の進展機構を総括的に理解し、その全体像を解明することを通して、より効果的、かつ特異的な治療、予防法の開発を目指す。

3.研究目的

 心臓病や脳血管障害などの循環器疾患の進展や、慢性腎不全の進展には、高血圧の関与や、アンジオテンシン等の血管作動性物質の異常が関与していることが断片的に理解されているものの、その全貌が明らかになっているとはいい難い。試験管内で再現可能な実験だけでは、病態の1つの側面を反映してはいるものの、その全体像を捉えるためには生体系を用いた検討、すなわち動物実験が不可欠である。しかし一方で、動物に薬剤を投与してその効果を見るというスタイルの動物実験では特定の細胞で、特定の期間に、特定の要因に1つ1つ焦点を当てた研究を行うことは困難で、その解析はおおまかなものにならざるを得ない。本プロジェクトでは、(1) アンジオテンシンの慢性腎不全および循環器疾患の増悪における役割を、その全身的作用と局所的作用に分離して詳細に解明する、(2) その為に必要な動物モデルを遺伝子操作技術を利用して作製する、(3) 最終的にはこれらの病気の進展機序を総合的に理解することを通じて、治療の対象になりうるターゲットを特定することを目標とする。

4.研究成果の概要

4−1 研究計画、目的に対する成果
 以前我々が作製したアンジオテンシノーゲン(Agt)や1型アンジオテンシン受容体(AT1)のノックアウト(KO)マウスに加えて、レニンKOマウスを作製した。その解析の結果、Agt KOマウスやAT1 KOマウスで観察されていた腎臓血管系の中膜肥厚、糸球体硬化性病変は過剰なレニンによるものではないことが確認され、未だ不明な機序の存在があることが判明した。
 アンジオテンシンの作用モードを全身的なものと局所的なものとに分離して検討するための生体系として、胚集合法を利用してAT1欠損細胞とAT1非欠損細胞の2種類の細胞が斑状に分布するキメラマウスを作製した。摂取Na量の制限にともなう副腎でのアルドステロン合成調節を解析したところ、基礎状態でのアルドステロン合成および塩分制限による2次性高アルドステロン血症の成立には、副腎局所におけるアンジオテンシンIIの働きが必須であると同時に、カリウムの重要性も明確に示された。また、同キメラマウスにアンジオテンシンを持続注入した際の心臓の繊維化、腎糸球体における細胞増殖、血管平滑筋細胞の増殖を検討した結果、従来考えられていた以上に、全身的な作用が生体内では重要であることが確認された。
 ラットThy1抗体腎炎モデルにおいて、片側の腎臓にのみAT1のアンチセンスオリゴをエレクトロポレーション法により導入して、腎局所におけるアンジオテンシンの作用を阻害すると、導入側においてのみ腎炎が軽減され、組織傷害時においてはアンジオテンシンが局所的に作用して腎傷害の進展に関与していることが示された。
 AT1 KOマウスにおけるマクロファージの機能の解析により、遊走能や殺菌作用に必要な分子の産生において異常が確認された。さらに、骨髄移植法を用いて骨髄由来細胞のみがAT1を欠損するマウスを作製し、尿管結紮により惹起される腎繊維化を検討した。その結果、マクロファージはアンジオテンシンの作用を受けて繊維化の進行を抑制していることが示された。
 マウスを用いて進行性腎傷害の機序を解明するためには、再現性よく糸球体硬化を誘導できるマウスモデルの開発が必須である。糸球体硬化にしばしば糸球体上皮細胞傷害が伴うという、過去の観察に基づき、我々は、任意の時に、糸球体上皮細胞を特異的に傷害できるトランスジェニックマウスを作製した。このマウスは、多量の蛋白尿、全身浮腫、腹水を呈し、最終的には腎不全となり、病理学的には、糸球体上皮細胞の障害像、最終的には糸球体硬化像を示した。すなわち、糸球体上皮細胞の損傷が、糸球体硬化へと不可逆的に直結することが実証された。
 細胞特異的に遺伝子を不活化するマウスの作製は、AgtとAT1の各遺伝子について行われた。遺伝子相同組み換えを利用して2ケ所のloxP配列が挿入されたマウスと、細胞特異的にCre酵素を発現するトランスジェニックマウスの両方を作製し、それぞれを交配させることにより、最終的に細胞特異的な遺伝子不活化マウスが得られるため、長期間を要している。現在、糸球体上皮細胞、近位尿細管細胞における遺伝子不活化マウス作製のための最終段階の交配が行われており、近い将来において遺伝子不活化の細胞特異性や、不活化の効率の良否を確認後、表現型の解析が可能となる見通しである。

4−2 研究計画、目的外の成果
 特になし

4−3 研究成果の展望
 本プロジェクトにおいては、循環器疾患、腎疾患の進展機序の研究において、生体系を用いることの重要性を常に念頭において研究が遂行されてきた。同時に、生体系でなければ解析が困難なアンジオテンシンの作用モードに関して、全身的なものと局所的なものとに分離するという、ユニークな観点から、種々の系を独自に作製し、解析が行われた点も意義深いと考える。すなわち、従来の古典的な遺伝子欠損マウスに加えて、胚集合法によるキメラマウス、骨髄移植によるキメラマウス、アンチセンスの局所的導入による遺伝子の不活化など、種々の生体解析系が有用であることが示された。その結果、試験管内で示されてきた事実からは予想できない、アンジオテンシンの生体における様々な作用が明らかとなった。また、組織傷害が生じている時と平常時とでは、アンジオテンシンが作用するモードに違いがあることも明らかとなり、傷害の進展を阻止するための治療戦略を考える際にも、全身的な要因をターゲットにしたものと局所的な要因をターゲットにしたものに分けて戦略を考える必要があることが示された
 さらに、本プロジェクトにおいて開発された、糸球体上皮細胞に特異的にヒトCD25を発現するトランスジェニックマウスにイムノトキシンを静注することにより誘導される新たな腎炎モデルは、糸球体硬化の機序に関する根源的な機序を解明する重要な足掛かりを提供したと自負している。また、このモデルは治療手段のスクリーニング等に極めて有用であり、計り知れない可能性を秘めており、腎臓病学の新たな展開を可能にするものと期待される。

4−4 本事業の趣旨に鑑み、果たした役割
 循環器疾患、腎疾患の進展機序に関して、生体系を用いた研究がさらに推進されるべきであることが本プロジェクトにより確認され、今後あるべき研究の方向性を明確に示した。また、本プロジェクトにおいて独自に作製された、あるいは作製中の動物モデルは、アンジオテンシン以外の種々の血管作動性物質や増殖因子がいかに生体内において関与しているのかを解析するための方法論を考える上で、重要な足掛かりを提供するものである。
 糸球体硬化の発症機序は、進行性腎障害の進展機序を解明する上で必ず解明されなければならない病態である。この糸球体硬化のメカニズムに関しては従来から積極的な研究が行われているが、本プロジェクトにおいて開発されたマウスにおける新たな腎炎モデルは、糸球体硬化の機序に関して、明確な解答を提供する極めて有用な動物モデルとして重要な位置を占めるものとなる。また、糸球体硬化を阻止する治療手段をスクリーニングする系としても極めて有用であり、治療法の開発にも多大な貢献をすることが期待される。

5.キーワード

(1)心不全 (2)慢性腎不全 (3)糸球体硬化
(4)ノックアウトマウス (5)キメラマウス (6)骨髄移植
(7)高血圧 (8)レニン (9)アンジオテンシン

6.研究成果発表状況

A.学術雑誌論文(Journal Papers)
全著者名 論文名
Miyazaki Y, Oshima K, Fogo A, Ichikawa I Evidence that bone morphogenetic protein 4 has multiple biological functions during kidney and urinary tract development
学術雑誌名 ページ 発行年
Kidney Int. 63 3 835-844 2003

全著者名 論文名
Nishida M, Fujinaka H, Matsusaka T, Price J, Kon V, Fogo AB, Davidson JM, Linton MF, Fazio S, Homma T, Yoshida H, Ichikawa I Absence of angiotensin II type 1 receptor in bone marrow-derived cells is detrimental in the evolution of renal fibrosis
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Clin. Invest. 110 12 1859-1868 2002

全著者名 論文名
Takaya J, Matsusaka T, Katori H, Tamura H, Miyazaki Y, Homma T, Ichikawa I In situ demonstration of angiotensin-dependent and independent pathways for hyperaldosteronism during chronic extracellular fluid volume depletion
学術雑誌名 ページ 発行年
Mol. Endocrinol. 15 12 2229-2235 2001

全著者名 論文名
Oshima K, Miyazaki Y, Brock III JW, Adams MC, Ichikawa I, Pope IV JC Angiotensin type II receptor expression and ureteral budding
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Urol. 166 5 1848-1852 2001

全著者名 論文名
Matsusaka T, Kon V, Takaya J, Katori H, Chen X, Miyazaki Y, Homma T, Fogo A , Ichikawa I Dual Renin Gene Targeting by Cre-Mediated Inter-Chromosomal Recombination
学術雑誌名 ページ 発行年
Genomics 64 2 127-131 2000

全著者名 論文名
Fujinaka H, Miyazaki Y, Matsusaka T, Yoshida H, Fogo A, Inagami T, Ichikawa I Salutary role for angiotensin in partial urinary tract obstruction
学術雑誌名 ページ 発行年
Kidney Int. 58 5 2018-2027 2000

全著者名 論文名
Matsusaka T, Katori H, Inagami T, Fogo A, Ichikawa I Communication between myocytes and fibroblasts in cardiac remodeling in angiotensin chimeric mice
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Clin. Invest. 103 10 1451-1458 1999

全著者名 論文名
Tsuchida S, Miyazaki Y, Matsusaka T, Hunley TE, Inagami T, Fogo A, Ichikawa I Potent antihypertrophic effect of the bradykinin B2 receptor system on the renal vasculature
学術雑誌名 ページ 発行年
Kidney Int. 56 2 509-516 1999

全著者名 論文名
Nishimura H, Yerkes E, Hohenfellner K, Miyazaki Y, Ma J, Hunley TE, Yoshida H, Ichiki T, Threadgill D, Phillips III JA, Hogan BM, Fogo A, Brock III JW, Inagami T, Ichikawa I Role of the angiotensin type 2 receptor gene in congenital anomalies of the kidney and urinary tract, CAKUT, of mice and men
学術雑誌名 ページ 発行年
Mol. Cell. 3 1 1-10 1999

全著者名 論文名
Miyazaki Y, Tsuchida S, Fogo A, Ichikawa I The renal lesions that develop in neonatal mice during angiotensin inhibition mimic obstructive nephropathy.
学術雑誌名 ページ 発行年
Kidney Int. 55 5 1683-1695 1999


全著者名 論文名
Cheng HF, Wang JL, Zhang MZ, Miyazaki Y, Ichikawa I, McKanna JA, Harris RC Angiotensin II attenuates renal cortical cyclooxygenase-2 expression
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Clin. Invest. 103 7 953-961 1999

全著者名 論文名
Miyazaki Y, Tsuchida S, Nishimura H, Pope IV JC, Harris RC, McKanna JM, Inagami T, Hogan BLM, Fogo A, Ichikawa I Angiotensin induces the urinary peristaltic machinery during the perinatal period
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Clin. Invest. 102 8 1489-1497 1998

全著者名 論文名
Ma J, Nishimura H, Fogo A, Kon V, Inagami T, Ichikawa I Accelerated fibrosis and collagen deposition develop in the renal interstitium of angiotensin type 2 receptor null mutant mice during ureteral obstruction
学術雑誌名 ページ 発行年
Kidney Int. 53 4 937-944 1998

全著者名 論文名
Okubo S, Niimura F, Matsusaka T, Fogo A, Hogan BLM, Ichikawa I Angiotensinogen gene null-mutant mice lack homeostatic regulation of glomerular filtration and tubular reabsorption
学術雑誌名 ページ 発行年
Kidney Int. 53 3 617-625 1998

全著者名 論文名
Tsuchida S, Matsusaka T, Chen X, Okubo S, Niimura F, Nishimura H, Fogo A, Utsunomiya H, Inagami T, Ichikawa I Murine double nullizygotes of the angiotensin type 1A and 1B receptor genes duplicate severe abnormal phenotypes of angiotensinogen nullizygotes
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Clin. Invest. 101 4 755-760 1998


B.国際会議発表論文(International Conferences)
全著者名 論文名
Taiji Matsusaka, Agnes,Fogo, Kazuto Kobayashi, Ira Pastan, Iekuni Ichikawa Establishment of a transgenic mouse model that allows experimental time-, site-, magnitude-selective removal of podocytes that is followed by glomerular sclerosis
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
4th International Symposium on Podocyte Biology Niigata (Japan) 21 42 2002

全著者名 論文名
Taiji Matsusaka, Toshio Homma, Akira Akatsuka, Agnes Fogo, Iekuni Ichikawa Selective Podocyte Injury Causes Rapid Progression to Glomerulosclerosis (GS) in Transgenic Mice (TG) Equipped with Inducible Magnitude-Selectable Podocyte-Damaging System
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 2002 Annual meeting Philadelphia SU-F213 44A 2002

全著者名 論文名
Jing Xin, Taiji Matsusaka, Ji Ma, Yoshitaka Isaka, Enyu Imai, Iekuni Ichikawa Transfection of Skeletal Muscles with Transforming Growth Factor-β(TGF-β) Receptor -IgG Fc Chimeric Protein Abrogates the In Vivo Cyclosporine A(CsA) Nephrotoxicity
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 2002 Annual meeting Philadelphia SA-P0233 311A 2002

全著者名 論文名
Ji Ma, Jing Xin, Taiji Matsusaka, Fuji Shimizu, Yutaka Kaachi, Yoshitaka Isaka, Enyu Imai, Iekuni Ichikawa Selective Suppression of Mesangial Angiotensin (Ang) Type 1 Receptor (AT1) by In Vivo Transfection of Anti-Sense Oligodeoxynucleotide (AS-ODN) Reveals Direct Action of Ang II in Rat Thy-1 Nephritis (Thy-1)
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 2002 Annual meeting Philadelphia (USA) SA-FC174 36A 2002

全著者名 論文名
Toshio Homma, Taiji Matsusaka, Seiki Tazume, Iekuni Ichikawa Attenuated Inflammatory Response of Macrophages (M) Underlies the Increased Susceptibility of Angiotensin Type 1a Receptor-Deficiendt (Agtr1a-/-) Mice to Listeria Monocytogenes Infection
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
ASN/ISN World Congress of Nephrology 2001 Annual meeting San Francisco (USA) A3396 653A 2001

全著者名 論文名
F. Kuwayama, Y. Miyazaki, I. Ichikawa Can Ectopic Ureteral Budding Alone Cause All the Abnormal Features of the Congenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract (CAKUT)?
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
ASN/ISN World Congress of Nephrology 2001 Annual meeting San Francisco (USA) A2280 555A 2001

全著者名 論文名
M. Nishida, H. Fujinaka, T. Matsusaka, V. Kon, A. Fogo, S. Fazio, H. Yoshida, I. Ichikawa Protective Effect of Macrophage Angiotensin II Type 1 Receptor on the Evolution of Obstructive Nephropathy
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
ASN/ISN World Congress of Nephrology 2001 Annual meeting San Francisco (USA) A3712 712A 2001

全著者名 論文名
M. Nishida, H. Fujinaka, T. Matsusaka, V. Kon, A. Fogo, S. Fazio, H. Yoshida, I. Ichikawa Macrophage-Derived Angiotensin II (Ang II) Protects Against Ureteral Obstruction-Induced Fibrosis
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
ASN/ISN World Congress of Nephrology 2001 Annual meeting San Francisco (USA) A3713 712A 2001

全著者名 論文名
Junji Takaya, Taiji Matsusaka, Hideyuki Katori, Agnes Fogo, Iekuni Ichikawa Systemic Angiotensin Has No Local Impact on the DNA Synthesis in the Glomerulus In Vivo
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 2000 Annual meeting Toronto A1946 372A 2000

全著者名 論文名
Junji Takaya, Taiji Matsusaka, Hideyuki Katori, Iekuni Ichikawa Angiotensin and Potassium Are Complementary to Each Other in Achieving Secondary Hyperaldosteronism in Chronic ECF Volume Depletion
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 2000 Annual meeting Toronto A2250 428A 2000

全著者名 論文名
Y. Miyazaki, K. Oshima, A. Fogo, I. Ichikawa BMP4 Is a Multipotent Regulator for the Kidney and Urinary Tract Development
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 2000 Annual meeting Toronto (Canada) A1987 379A 2000

全著者名 論文名
Keisuke Oshima, Yoichi Miyazaki, John W. Brock III, Mark C. Adams, Iekuni Ichikawa, John C. Pope IV Effects of Angiotensin Type-2 Receptor (AT2) Activation on Ureteral Budding
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 2000 Annual meeting Toronto (Canada) A1992 380A 2000

全著者名 論文名
Hidehiko Fujinaka, Hiroaki Yoshida, Taiji Matsusaka, Yoichi Miyazaki, Masashi Nishida, MacRae M. Linton, Agnes B. Fogo, Sergio Fazio, Iekuni Ichikawa Protective Role for the Angiotensin II Type 1A Receptor on Bone Marrow-Derived Macrophages in the Formation of Renal Fibrosis
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 2000 Annual meeting Toronto (Canada) A3262 618A 2000

全著者名 論文名
T. Matsusaka, H. Nakazato, J. Takaya, H. Katori, V. Kon, A. Fogo, I. Ichikawa Dual Renin Gene Targeting by Cre-Mediated Interchromosomal Recombination
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 1999 Annual meeting Miami Beach (USA) A1766 350A 1999

全著者名 論文名
T. Matsusaka, H. Nakazato, J. Takaya, H. Katori, V. Kon, A. Fogo, I. Ichikawa Vascular Hypertrophy in Dual Renin Null Mutant Mice
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 1999 Annual meeting Miami Beach (USA) A1767 350A 1999

全著者名 論文名
Y. Miyazaki, K. Oshima, T. Kume, R. Dunn, A. Fogo, B. L. M. Hogan, I. Ichikawa Ontogeny of the Congenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract (CAKUT) : BMP4 Determines the Site of Initial Ureteral Budding on the Wolffian Duct (WD)
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 1999 Annual meeting Miami Beach (USA) A2058 408A 1999

全著者名 論文名
Y. Miyazaki, K. Oshima, T. Kume, R. Dunn, A. Fogo, B. L. M. Hogan, I. Ichikawa Ontogeny of the Congenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract (CAKUT) : Incomplete Elongation of the Branching Ureter Leads to Hypo-Dysplastic Kidney in Heterozygous Bmp4 Knockouts (Bmp4 +/-)
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 1999 Annual meeting Miami Beach (Canada) A2059 408A 1999

全著者名 論文名
J. Takaya, T. Matsusaka, H. Katori, I. Ichikawa Hyperaldosteronism Secondary to Chronic Extracellular Fluid Depletion (2oHA) Is Not Caused by Angiotensin II (AII)
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 1999 Annual meeting Miami Beach (USA) A2332 462A 1999

全著者名 論文名
H. Fujinaka, Y. Miyazaki, H. Yoshida, A. Fogo, I. Ichikawa Role of Angiotensin in the Adaptation of Urinary Peristaltic Machinery during Partial Urinary Tract Obstruction in Adult Animals
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発表年
American Society of Nephrology 1999 Annual meeting Miami Beach (USA) A3338 658A 1999


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