平成13年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業研究成果報告書概要



研究推進分野名 生体分子の構造と機能調節(構造生物学と機能分子)
 
研究プロジェクト名 RNAの構造生物学
 
(英文名) Structural Biology of RNA
 
研究期間 平成9年度 〜 平成13年度

プロジェクト・リーダー名 研究経費 368,050千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名
河合剛太 ・千葉工業大学 ・工学部 ・助教授 内訳 平成 9年度121,168千円
平成10年度60,782千円
平成11年度71,100千円
平成12年度54,700千円
平成13年度60,300千円

1.研究組織

氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
武藤 裕 東京大学・大学院理学系研究科・講師 RNA結合タンパク質によるRNA認識機構の解析
竹中 章郎 東京工業大学・生命理工学部・助教授 X線結晶構造解析によるRNA立体構造の解析
新田 至 東京大学・大学院工学系研究科・助手 RNA結合タンパク質によるRNA認識機構の解析(平成11年5月31日まで)
上杉 晴一 横浜国立大学・工学部・教授 NMRによるRNA立体構造の解析
高久 洋 千葉工業大学・工学部・教授 NMRによるRNA立体構造の解析
鈴木 勉 東京大学・大学院新領域創成科学研究科・講師 RNAとタンパク質の機能的互換性の解析(平成12年4月1日から)

2.研究計画の概要

近年,生命活動のさまざまな局面においてRNAの関与・重要性が発見され,高次構造に基づくRNAの機能発現メカニズムの解明を主要テーマとする「RNAの構造生物学」が,生物学のみならず,医学,薬学,工学のさまざまな分野で極めて重要な課題として認識されつつある.例えば,生命のもっとも基本的な活動であるタンパク質の生合成において,RNAはその機能発現に中心的な役割を担っており,これに関与するRNAについての研究は生命工学にとっても重要である.実際に,プロジェクトの期間中に相次いで発表されたリボソームの結晶構造は,リボソーム上における反応がRNAによって行われていることの決定的な証拠をもたらしている.また,エイズウイルスの遺伝子はRNAであり,その構造と機能について知ることは,エイズの治療につながると期待できる.
 本プロジェクトでは,このような背景のもと,プロジェクト開始時点において不十分であると考えられたRNA立体構造解析の方法論において独自の展開をはかり,それを最大限に活用してRNA分子の「機能する姿」を明らかにすることをめざした研究を計画した.現在の構造生物学の主要な手法は,NMR,X線結晶構造解析およびコンピュータである.本プロジェクトでは,そのなかでもNMRを中心に,X線結晶解析およびコンピュータシミュレーションとも連携しながら,さまざまな生命現象に関与するRNA分子およびRNA結合タンパク質とRNA分子の複合体について,方法論の開発と並行して,それらの構造解析を進めることを計画した.さらに,RNAに関する生化学的あるいは分子生物学的な最先端の研究を行っている研究者と連携することによって広く研究対象を探査し,構造生物学の研究対象とすることも積極的に推進することとした.

3.研究目的
本プロジェクトの目標は,新しいRNA機能構造解析法を開発し,さらにこれによって「機能するRNA」の姿を描き出し,RNAの構造生物学を体系化することである.研究プロジェクトがめざした開発・解析の目的は次の通りである.
・ RNAの立体構造を決定するための試料調製手法を確立する.
・ NMRによるRNAの立体構造解析の手法の確立および改良を行う.
・ X線結晶解析法について,RNAの結晶化の手法を向上させる.
・ 具体的な研究対象を選び,RNAの立体構造解析を行う.
・ 具体的な研究対象を選び,RNAとRNA結合タンパク質の相互作用を解析する.
・ RNAの構造変換を計算機上でシミュレーションする手法についても検討する.
・ RNAに関する研究者と連携することによって広く研究対象を探査し,構造生物学の研究対象とする.
・ 得られた解析結果を総合し,RNAの構造生物学を体系化する.

4.研究成果の概要
4−1 研究計画、目的に対する成果
プロジェクトの開始当初に,酵素による試験管内転写法および自動合成機による化学合成のいずれの手法によってもNMRあるいはX線結晶構造解析に必要な量および質のRNA試料の調製システムを立ち上げ,5年間にわたり解析のために利用すると共に,共同研究を進めている複数の研究室にRNA試料を供給した.また,主として試験管内転写法を利用して安定同位体標識RNAの調製を行い,NMRによる立体構造解析あるいはRNA結合タンパク質との相互作用の解析に活用した.これらの試料を用いて,実際に,HIV-1の二量体化開始部位のRNA(DIS),ヒトSRP RNAのSRP19タンパク質であるhelix 6およびtmRNAに含まれるシュードノット構造(PK1)について立体構造をほぼ決定した.また,X線結晶構造解析においても,DISの単結晶を得ることができ,これらを通じてRNAの結晶化の難しさとその対処に仕方も明らかになったのは大きな進展であった.一方,RNAとRNA結合タンパク質との相互作用の解析についても,NMR法およびX線結晶構造解析を活用して,SxlおよびU2AFの系について成果を挙げた.RNAの構造計算に関しては,RNAの立体構造の基本要素である塩基対とスタッキングの項を明示的に導入した力場を作成したところ,構造計算の収束度が向上した.また,プロジェクトの期間中に開発された残余双極子相互作用を利用する手法についてもただちに導入を試みている.しかしながら,RNAの構造変換を計算機上でシミュレーションする手法については,今後の課題として残っている.これについては,NMR法によって決定した立体構造に基づいて基準振動解析により運動性を解析し,構造変化の方向を推定することを試みており,このような解析と分子動力学計算を併用することで解析を進めることを計画している.本研究プロジェクトでは,年1回の頻度でRNAに関わる様々な分野で研究を進めている研究者を集めてミーティングを行い,積極的に共同研究を進めた.実際に,ポリアミンのmRNAの立体構造への効果,テロメラーゼRNAの解析,あるいは,超好熱性古細菌のRNA結合タンパク質の構造解析など,新しい研究課題について,研究が進められた.以上のように,本プロジェクトは順調に推進され,多くの成果を挙げた.今後もこのような積極的な研究を進めていくことによってRNAの立体構造あるいはタンパク質との相互作用についての理解を深め,RNAの構造生物学を体系化していきたいと考えている.

4−2 研究計画、目的外の成果
本研究プロジェクトの期間中に,X線結晶構造解析によってリボソームの立体構造が相次いで決定された.リボソームは,RNAを中心とした巨大な複合体であり,その立体構造が決定されたということは,膨大なRNAの立体構造情報が得られたことを意味している.そこで,この立体構造情報を統計的に解析し,RNAにおける核酸塩基間の相対配置のデータベースを作成した.それによって,通常のワトソン・クリック型の塩基対に対する非ワトソン・クリック型塩基対の割合や,それぞれの塩基対の頻度など,多くの有用な情報を得ることができた.現在,このデータベースを利用した力場パラメータを作成することによって,RNAの立体構造計算の高効率化・高精密化を実現することを計画している.一方,本プロジェクトにおいては,立体構造を自由に眺め,あるいは表示できることが重要であった.プロジェクトの一部として卒業研究を行った学生が,その後,高機能で安価な立体構造表示プログラムを開発し,ベンチャーとして商品化を行ったことは,プロジェクトの成果ではないが,まさに目的外の収穫であった.

4−3 研究成果の展望
日本においてRNA研究は従来から活発であったが,近年RNAの様々な現象への関与が明らかにされるにつれて,その勢いを増している.このような状況の中,平成11年度に日本RNA学会が設立され,平成13年8月にはその第3回年会が開催された.しかしながら,この会においてRNAの立体構造についての発表を行ったのはプロジェクトリーダーのグループだけであり,また立体構造決定をめざした研究発表を行った3つのグループのうち,横浜国大・上杉晴一博士(NMR)および東工大・竹中章郎博士(X線結晶構造解析)についても,未来開拓プロジェクトのメンバーであった.もうひとつの構造解析グループは,理化学研究所のグループであるが,研究対象はRNAとタンパク質の複合体としてのリボソームである.いずれにせよ,国内においてRNA分子の立体構造解析を進めている研究室・グループの数は少なく,本研究プロジェクトがこの分野の発展あるいは拡大に貢献したことは確かであり,日本におけるRNA研究だけではなく構造生物学の発展のためにも極めて重要な貢献を行ったと考えている.
日本におけるRNA研究分野では,文部省の重点領域研究あるいは文部科学省の特定領域研究が重要な役割を果たしてきた.当プロジェクトと時を同じくして平成9年度に特定領域研究「RNA動的機能の分子基盤」が発足し,平成12年度まで日本におけるRNA研究を支えた.しかしながら,立体構造解析を行う際には,分子生物学的な実験とは文字通り桁違いの試料の量が必要であり,また,大規模な装置と安定同位体標識化合物に代表される高額な試薬が必要である.したがって,この分野においては,プロジェクト型の研究を推進することが必要不可欠であり,むしろ本研究プロジェクトが,特定領域研究と相補的に機能し,国内で発見されるさまざまなRNAによる生命現象についての構造生物学的な研究を積極的に後押ししたといえる.すなわち,本研究プロジェクトの学問的あるいは学術的な影響力は極めて大きかった.

4−4 本事業の趣旨に鑑み、果たした役割
21世紀の重要な産業の一つは,いわゆるバイオ産業であり,そのターゲットのひとつとしてRNAは重要である.また,昨今のポストゲノムプロジェクトの当然の流れであるが,国内外においてゲノム情報に基づく網羅的なRNA遺伝子の解析の動きも出ており,RNomics(リボヌクレオミクス)という造語も登場している.しかしながら,RNAの構造ゲノム解析については,海外においてVaraniらがその必要性を主張しているが,現状ではまだ始動していないと思われる.この分野における国内の萌芽的な研究としては,筑波大学の中村らのグループによる,枯草菌あるいは毒素産生菌であるウェルシュ菌についての解析,あるいは慶応義塾大学の金井らのグループによる超好熱性古細菌について網羅的なRNAの検索が始められている.これらのグループはいずれも当研究プロジェクトの研究ミーティングに参加しており,立体構造を含めた解析が必須であるということを理解している.したがって,このような研究グループが立体構造を視野に入れたゲノム解析を進めていることは,国内におけるRNAのバイオ産業の活性化を加速すると考えられる.また,RNAを利用した医薬品の開発などのプロジェクトも始まっているが,これらにも立体構造解析を視野に入れているものがあり,RNAの構造ゲノム解析プロジェクトが国内で発足するのも遠くないと考えている.当研究プロジェクトはこのような潮流を形成するきっかけのひとつであったと自負している.
立体構造解析を行うためには高度な技術の習得と多くの経験を積むことが必要である.したがって,本研究において,研究支援者を雇用し,将来の発展を担うことのできる人材を育成できたことは,日本におけるRNA研究分野の総合的な発展に重要であることは明らかである.
以上のように,これからますます発展することが期待できるRNAの分野において,その構造と機能の関係を例示し,さらに方法論と人材を供給したという点において,本プロジェクトは未来を開拓したといえるであろう.

5.キーワード

(1)RNA、(2)立体構造、(3)NMR
(4)X線結晶構造解析、(5)RNA結合タンパク質、(6)相互作用
(7)二段階二量体化、(8)SRP RNA 、(9)tmRNA

6.研究成果発表状況

A.学術雑誌論文(Journal Papers)
全著者名 論文名
Aya Kitamura, Yutaka Muto, Satoru Watanabe, Insil Kim, Takuhiro Ito, Yoichi Nishiya, Kensaku Sakamoto, Takashi Ohtsuki, Gota Kawai, Kimitsuna Watanabe, Kazumi Hosono, Hirohsi Takaku, Etsuko Katoh, Toshimasa Yamazaki, Tan Inoue, and Shigeyuki Yokoyama Solution Structure of an RNA fragment with the P7/P9.0 region and the 3'-terminal guanosine of the Tetrahymena group I intron
学術雑誌名 ページ 発行年
RNA ??? ??? ??? 2002

全著者名 論文名
Masaru Tsunoda, Jiro Kondo, Naoko Karino, Yoshihito Ueno, Akira Matsuda, and Akio Takenaka Water mediated Dickerson-type crystal of DNA dodecamer containing 2'-deoxy-5-formyluridine
学術雑誌名 ページ 発行年
Biophys. Chem ??? ??? ??? 2002

全著者名 論文名
M. Tofazzal Hossain, Jiro Kondo, Yoshihito Ueno, Akira Matsuda and Akio Takenaka X-Ray analysis of d(CGCGAATTXGCG)2 containing 2'-deoxy-N4-methoxycytosine residue at X: A characteristic pattern of sugar puckers in crystalline state of the Dickerson-Drew-type DNA dodecamers
学術雑誌名 ページ 発行年
Biophys. Chem. 95 ??? 69-77 2002

全著者名 論文名
M. Tofazzal Hossain, Takaaki Hikima, Toshiyuki Chatake, Masaru Tsunoda, Tomoko Sunami, Yoshihito Ueno, Akira Matsuda and Akio Takenaka Crystallographic Studies on Damaged DNAs, III. N4-Methoxycytosine can form both Watson-Crick type and wobbled base pairs in a B-form duplex
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biochem. 130 ??? 9-12 2001

全著者名 論文名
Ken-ichi Takahashi, Seiki Baba, Yoshio Koyanagi, Naoki Yamamoto, Hiroshi Takaku, and Gota Kawai Two basic regions of NCp7 are sufficient for conformational conversion of HIV-1 dimerization initiation site from kissing-loop dimer to extended-duplex dimer
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 276 ??? 31274-31278 2001

全著者名 論文名
Kouji Nakamura, H. Miyamoto, S. Suzuma, Taiichi Sakamoto, Gota Kawai, and Kunio Yamane Minimal functional structure of Escherichia coli 4.5S RNA required for binding EF-G
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 276 ??? 22844-22849 2001

全著者名 論文名
Takashi Ohtsuki, Yoichi Watanabe, Chie Takemoto, Gota Kawai, Takuya Ueda, Kiyoshi Kita, S. Kojima, Y. Kaziro, J. Nyborg, and Kimitsuna Watanabe An "Elongated" translation elongation factor Tu for truncated tRNAs In nematode mitochondria
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 276 ??? 21571-21577 2001

全著者名 論文名
Madoka Yoshida, Keiko Kashiwagi, Gota Kawai, Akira Ishihama, and Kazuei Igarashi Polyamine Enhancement of the Synthesis of Adenylate Cyclase at the Translational Level and the Consequential Stimulation of the Synthesis of the RNA Polymerase s28 subunit
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 276 ??? 16289-16295 2001

全著者名 論文名
M. Tofazzal Hossain, Tomoko Sunami, Masaru Tsunoda, Takaaki Hikima, Toshiyuki Chatake, Yoshihito Ueno, Akira Matsuda and Akio Takenaka Crystallographic studies on damaged DNAs IV. N4-methoxycytosine shows a second face for Watson-Crick base-pairing, leading to purine transition mutagenesis
学術雑誌名 ページ 発行年
Nucl. Acids Res. 29 ??? 3949-3954 2001

全著者名 論文名
Masaru Tsunoda, Naoko Karino, Yoshihito Ueno, Akira Matsuda and Akio Takenaka Crystallization and preliminary X-ray analysis of a DNA dodecamer containing 2'-deoxy-5-formyluridine; what is the role of magnesium cation in crystallization of Dickerson-type DNA dodecamers?
学術雑誌名 ページ 発行年
Acta Crystallogr. D57 ??? 345-348 2001

全著者名 論文名
Ken-ichi Takahashi, Seiki Baba, Yojiro Hayashi, Yoshio Koyanagi, Naoki Yamamoto, Hiroshi Takaku, and Gota Kawai NMR analysis on intra- and inter-molecular stems in the dimerization initiation site of the HIV-1 genome
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biochem. 127 ??? 681-639 2000

全著者名 論文名
Ken-ichi Takahashi, Seiki Baba, Pratima Chattopadhyay, Yoshio Koyanagi, Naoki Yamamoto, Hiroshi Takaku, and Gota Kawai Structural Requirement for the Two-Step Dimerization of Human Immunodeficiency Virus Type-1 Genome
学術雑誌名 ページ 発行年
RNA 6 ??? 96-102 2000

全著者名 論文名
Insil Kim, Yutaka Muto, Satoru Watanabe, Aya Kitamura, Yasuhiro Futamura, Shigeyuki Yokoyama, Kazumi Hosono, Gota Kawai, Hiroshi Takaku, Naoshi Dohmae, Koji Takio, Kensaku Sakamoto, and Yoshiro Shimura Interactions of a didomain fragment of the Drosophila Sex-lethal protein with single-stranded uridine-rich oligoribonucleotides derived from the transformer and Sex-lethal messenger RNA precursors: NMR with residue-selective [5-H-2]uridine substitutions
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biomol. NMR 17 ??? 153-165 2000

全著者名 論文名
Makoto Inoue, Yutaka Muto, Hiroshi Sakamoto, and Shigeyuki Yokoyama NMR Studies on Functional Structures of the AU-rich Element Binding Domains of Hu Antigen C
学術雑誌名 ページ 発行年
Nucl. Acids Res. 28 ??? 1743-1750 2000

全著者名 論文名
Nobukazu Nameki, Pratima Chattopadhyay, Hyouta Himeno, Akira Muto, and Gota Kawai An NMR and mutational analysis of an RNA pseudoknot of E. coli tmRNA involved in trans-translation
学術雑誌名 ページ 発行年
Nucleic Acids Res. 27 ??? 3667-3675 1999

全著者名 論文名
Madoka Yoshida, Duangdeum Meksuriyen, Keiko Kashiwagi, Gota Kawai, and Kazuei Igarashi Polyamine stimulation of the synthesis of oligopeptide-binding protein (OppA). Involvement of a structural change of the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon AUG in OppA mRNA
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 274 ??? 22723-22728 1999

全著者名 論文名
Toshiyuki Chatake, Tomoko Sunami, Akira Ono, Yoshihito Ueno, Akira Matsuda and Akio Takenaka Crystallization and preliminary X-ray analysis of a DNA dodecamer of d(CGCGmo6AATCCGCG) containing 2'-deoxy-N6-methoxyadenosine: Change in crystal packing with different humidity
学術雑誌名 ページ 発行年
Acta Crystallogr. D55 ??? 873-876 1999

全著者名 論文名
Toshiyuki Chatake, Takaaki Hikima, Akira Ono, Yoshihito Ueno, Akira Matsuda & Akio Takenaka Crystallographic Studies on Damaged DNAs, II. N6-Methoxy-adenosine can Present Two Alternate Faces for Watson-Crick Base-pairing, Leading to Pyrimidine Transition Mutagenesis
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Mol. Biol. 294 ??? 1223-1230 1999

全著者名 論文名
Toshiyuki Chatake, Akira Ono, Yoshihito Ueno, Akira Matsuda and Akio Takenaka Crystallographic Studies on Damaged DNAs, I. An N6-Methoxyadenine Residue Forms a Watson-Crick Pairs with a Cytosine Residue in a B-DNA Duplex
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Mol. Biol. 294 ??? 1215-1222 1999

全著者名 論文名
Takuhiro Ito, Yutaka Muto, M. R. Green, and Shigeyuki Yokoyama Solution Sructures of the First and Second RNA-binding Domains of Human U2 Small Nuclear Ribonucleoprotein Particle Auxiliary Factor (U2AF65)
学術雑誌名 ページ 発行年
EMBO J. 18 ??? 4523-4534 1999

全著者名 論文名
Noriko Handa, Osamu Nureki, Kazuki Kurimoto, Insil Kim, Hiroshi Sakamoto, Yoshiro Shimura, Yutaka Muto, and Shigeyuki Yokoyama Structural Basis for tra mRNA Precursor Recognition by the Sex-lethal Protein
学術雑誌名 ページ 発行年
Nature 398 ??? 579-585 1999

全著者名 論文名
Duangdeum Meksuriyen, Tomomi Fukuchi-Shimogori, Hideyuki Tomitori, Keiko Kashiwagi, Toshihiko Toida, Toshio Imanari, Gota Kawai, and Kazuei Igarashi Formation of a complex containing ATP, Mg2+, and spermine. Structural evidence and biological significance.
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Biol. Chem 273 ??? 30939-30944 1998

B.国際会議発表論文(International Conferences)
全著者名 論文名
Gota Kawai, Nobukazu Nameki, Hiromi Shirakura, Hyouta Himeno, and Akira Muto Structure of an RNA pseudoknot, PK1, of E. coli tmRNA
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発行年
International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems Florence ??? ??? 2000


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