平成１３年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業研究成果報告書概要


研究推進分野名　細胞シグナリング
　
研究プロジェクト名　細胞接着による増殖シグナリングとその応用
　
（英文名）　Growth Signaling Transmitted by Cell Adhesion
　
研究期間　平成９年度 〜 平成１３年度

プロジェクト・リーダー名 研究経費 ２７０，７０５千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名		 目加田　英輔 ・大阪大学 ・微生物病研究所 ・教授 内訳 平成　９年度５１，９８１千円
平成１０年度５１，７５３千円
平成１１年度５３，５７１千円
平成１２年度５４，２９９千円
平成１３年度５９，１０１千円

１．研究組織

氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
岩本　亮 大阪大学・微生物病研究所・講師 in vitro juxtacrine assayの開発
宮戸健二 大阪大学・微生物病研究所・助手 HB-EGF mutant mouse作製
水島寛人 大阪大学・微生物病研究所・非常勤研究員 HB-EGF切断機構の解析
山崎　悟 大阪大学・微生物病研究所・リサーチアソシエイト HB-EGF mutant mouseの解析
平田道也 大阪大学・微生物病研究所・リサーチアソシエイト CD9 分子の機能解析
森部弘樹 大阪大学・微生物病研究所・リサーチアソシエイト 線虫におけるfetraspanin分子の機能解析

２．研究計画の概要

　本研究は、プロジェクトリーダーである目加田がこれまで扱ってきた膜結合型細胞増殖因子HB-EGFを主たる研究材料として、細胞接着を介した細胞増殖の制御機構の解明を目指すものである。研究は、HB-EGF複合体を構成するHB-EGF、CD9ファミリー、インテグリンa3b1について、「培養細胞レベル」と「個体レベル」の研究を併用し、その結果を相互にフィードバックしながら研究を進める。「培養細胞レベル」の研究では、膜結合型による細胞増殖抑制機構の解明、膜型から分泌型への変換機構の解明、複合体を構成する新規分子の探索、複合体形成に必用な部位の解析、を行う。このためには、それぞれの因子の過剰発現やドミナントネガティブの作成、あるいは中和抗体や無毒性ジフテリア毒素等の蛋白等、生化学、あるいは遺伝子工学的手法を駆使する。「個体レベル」での解析は、マウス等を用いて、発生過程や成体における複合体発現部位の詳細な調査、遺伝子ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスの作成、ウィルスベクターを利用したドミナントネガティブの強制発現を行い、その生理的機能の解明を目指す。
３．研究目的
　HB-EGFは、EGFファミリーに属する増殖制御因子で、EGFリセプターに結合して作用する。この分子には、膜結合型と分泌型の２種類が存在する。膜結合型には、1)隣接した細胞間でしか作用しない（ジャクスタクライン）、2)膜結合型増殖因子にアソシエートした膜蛋白分子が増殖因子の活性を調節できる、3)増殖因子とそのリセプター間で双方向のシグナル伝達が可能である、という特徴を持つ。これまでの研究で、HB-EGFが膜４回貫通型蛋白質であるCD9やその他のTM4SFタンパク、細胞間接着因子であるインテグリンa3b1、細胞外マトリックス成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカン、と複合体を形成していることを明らかにした。さらに、CD9がHB-EGFの機能を著しく上昇させることや、これらの複合体が細胞間接着部位に局在していることを見いだした。これらの事実は、これまで全く別々のカテゴリーに分類されてきた細胞増殖因子、細胞接着因子あるいは細胞外マトリックスが、一つの機能的コンプレックスを形成して、細胞接着部位で細胞シグナリングに働いていることを示唆している。本研究では、HB-EGF複合体の生理的役割の解明と、複合体を構成する個々の因子の機能解析を行い、細胞接着部位における増殖因子ー接着因子複合体による細胞増殖制御機構の解明を目標としている。
４．研究成果の概要
４−１　研究計画、目的に対する成果
１）培養細胞を用いた膜結合型HB-EGFの細胞増殖抑制作用に関する研究：生きたドナー細胞上で膜結合型HB-EGFの活性を測定する実験系を開発し、膜結合型HB-EGFには増殖抑制作用があること、その作用はEGFRによってアクセプター細胞に伝えられること、EGFRの自己リン酸化領域には増殖を抑制するシグナルを仲介する働きがあることが明らかにされた。
２）遺伝子ターゲッティングマウスを用いたHB-EGFの作用機構の解析：in vivoでの膜型、分泌型の役割を明らかにするために、あるいは膜型から分泌型への転換の生理的重要性を明らかにするために、HB-EGF欠損マウス、遺伝子ターゲッティングによって変異型HB-EGF遺伝子を持つマウス等を作成して、その解析を進めた。その結果、HB-EGFの膜型から分泌型への転換は、HB-EGFの作用機構に極めて重大で、厳密に制御されていることが明かとなった。また転換機構が異常になると、マウスの形態形成過程で致死的な異常を引き起こすことを示した。
３）膜結合型から分泌型への転換に関わる分子の同定と機構解析：膜型から分泌型への転換調節機構及びそれに関わるプロテアーゼに関して研究を進めた。その結果、HB-EGFの膜型から分泌型への転換は３種類の独立したシグナル伝達経路で制御されていることが明らかとなった。
４）CD9ノックアウトマウスによるCD9の生体における役割解析：CD9はHB-EGFやインテグリンと複合体を形成する性質があり、HB-EGFやインテグリンの機能のパートナー、あるいはモジュレーターとして働いていることが予想される。CD9自身の、あるいは複合体におけるCD9の役割を解析するために、CD9ノックアウトマウスを、通常のＥＳ細胞を用いたホモロガスリコンビネーション法で作成し、その表現形を解析した。その結果、CD9は、精子と卵子による受精過程で、精子が卵細胞膜と融合するために必須な因子としてはっきり証明された。
４−２　研究計画、目的外の成果
１）EGFリセプターに関する解析：HB-EGFの作用機構を考える上で、EGFリセプターの理解なしにはあり得ないと考え、EGFリセプターについても研究を進めた。その結果、インテグリンa2b1とEGFRの複合体が細胞間接着部位に存在すること、この複合体ではEGFRの活性化にインテグリンa2b1が関与していることを明らかにし、細胞間に存在するインテグリン_受容体複合体の新しい機能を示唆した。
２）線虫を用いたtetraspanin分子の機能解析：CD9が属するTM4ファミリー分子は多種類知られているが、いずれの分子もその細胞、個体での機能が不明である。これらをノックアウトを含めてマウスで解析していくのは、動物の飼育スペース、労力、予算的に困難である。一方、線虫には２０種類のTM4ファミリー分子が存在し、線虫の場合、ミュータントの分離、そのミュータントの表現型を増強したり抑制する別の遺伝子を分離する、などの手法が適応できるため、TM4ファミリーの機能解析を遺伝学的に押し進めることが可能となる。このような観点からCD9と比較的構造が類似している９種類のTM4ファミリー分子について、RNAiによる発現抑制を行い、その表現型を解析した。その結果、CD151とホモロジーが高い線虫TM4が抑制されると、線虫の表皮が剥離する、brister様の異常を示すことが明らかになった。この結果より、TM4と細胞基質間接着機能との関連が示唆された。
４−３　研究成果の展望
　HB-EGFはEGFファミリーの分子の中では発見が遅く、その生理的、病理的機能に関してはこれまであまりわかっていなかった。本研究によって、HB-EGFの個体での機能、その重要性が明らかにされた。遺伝子ターゲッティングマウスを用いた機能解析は、現在もその表現型を解析中であるが、マウスの発生、形態形成にきわめて重要であることを明らかにした。特に心臓において、その形成、機能維持、心肥大などの病理現象に非常に重大な役割をしていることが、明らかになりつつある。EGFファミリーの分子は遺伝子ノックアウトを行ってもきわめて微少な表現型しか示さないことが多いが、HB-EGFだけは様子が異なっており、この分子の生体における重要性が示唆される。本研究では、HB-EGFの膜型から分泌型への転換機構の解析に関しても大きな進展をみたが、これらの成果からHB-EGFの膜型から分泌型への転換（エクトドメインシェディング）とEGFRを介したポジティブフィードバック機構が、心肥大や血管狭窄などの循環器障害、癌細胞の過剰増殖機構などの疾病に深く関わっている可能性がクローズアップされてきた。おそらくHB-EGFの研究は、これらの疾病の原因と治療法の開発と深くリンクして多くの研究者を呼び込んだ分野となることが予想される。
　ＣＤ９を含むテトラスパニンの研究は、これまでは生化学的解析が主であり、その生理的役割を調べた研究はほとんどなされていない。本研究では、生理的機能を明らかにすることに集中して研究を進めた。その結果、ＣＤ９が受精過程で膜融合に重大な働きをしていることが明らかとなった。受精過程で膜融合に関わる分子については、これまでから多くの分子が候補として挙げられてきたが、未だ定まったものがなく、ノックアウトで融合過程に異常がでたのはＣＤ９がはじめてである。それゆえ、現在受精機構の研究は、ＣＤ９分子を中心に研究が進められており、この分野における我々の貢献は大きい。この研究成果をベースに、現在我々は、ＣＤ９や他のテトラスパニンファミリー分子がウィルス感染の際にも融合過程に関与しているのではないかと考え解析を進めている。今後は、受精過程に限らず、広く生命現象を見渡して、この分野の研究を進めていきたい。
４−４　本事業の趣旨に鑑み、果たした役割
　個々の研究テーマに関しては、予想以上に大きな成果を得ることができた。HB-EGFの解析では、循環器疾患や癌細胞の増殖・転移に関して今後さらなる成果が期待できる。それらの成果は新しい治療薬の開発につながるものと期待される。ＣＤ９の研究成果は不妊治療や不妊薬の開発、ウィルス感染症の理解と感染予防薬の開発の基礎となることが期待できる。その意味で本研究は大きく成功したものと考えている。未来開拓研究推進事業は、まとまった額の研究費を、５年間という長期に渡って援助されたことから、プロジェクトリーダーにとっては自分の研究を発展させる意味で大きく助けられた。もしこの資金がなかったなら、本研究テーマはその１０％も成果を出せていなかったように思われる。もちろん、これまでの成果と、「増殖因子ー接着因子複合体による細胞増殖制御機構の解明」という大目的の間には、まだ隔たりがあり、今後のさらなる努力が必要であると考えている。新しい生命科学分野の開拓に向けて、今後さらに研究を続けていきたいと考えている。

５．キーワード

(1)ＨＢ−ＥＧＦ、(2)ＥＧＦリセプター、(3)トランスアクチべーション
(4)ターゲッティングマウス、(5)ノックアウトマウス、(6)ＣＤ９
(7)受精、(8)細胞増殖

６．研究成果発表状況

A.学術雑誌論文（Journal Papers）
全著者名 論文名
Yu, X., Sharma, K. D., Takahashi, T., Iwamoto, R. and Mekada, E. Ligand-independent dimer formation of EGFR is a step separable from ligand-induced EGFR signaling
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Mol. Biol. Cell ??? ??? ??? 2002(inpress)

全著者名 論文名
Shimizu, T., Matsuishi, T., Iwamoto, R., Handa, K., Yoshioka, H., Kato, H., Ueda, S., Hara, H., Tabira, T. and Mekada, E. Elevated cerebrospinal fluid levels of anti-CD9 antibodies in patients with subacute sclerosing panencephalitis
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Infect. Dis. ??? ??? ??? 2002

全著者名 論文名
Hasuwa, H., Shishido, Y., Yamazaki, A., Kobayashi, T., Yu, X. and Mekada, E. CD9 amino acids critical for upregulation of diphtheria toxin binding
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 ??? 782-790 2001

全著者名 論文名
Miyamoto, S., Maruyama, A., Okugawa, K., Akazawa, K., Baba, H., Maehara, Y., Mekada, E. Loss of motility-related protein 1 (MRP1/CD9) and integrin alpha3 expression in endometrial cancers
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Cancer 92 ??? 542-548 2001

全著者名 論文名
Saito, M., Iwawaki, T., Taya, C., Yonekawa, H., Munehiro, N., Inui, Y., Mekada, E., Kimata, Y., Tsuru, A. and Kohno, K. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Nat. Biotechnol. 19 ??? 746-750 2001

全著者名 論文名
Umata, T., Hirata, M., Takahashi, T., Ryu, F., Shida, S., Takahashi, Y., Tsuneoka, M., Miura, Y., Masuda, M., Horiguchi, Y. and Mekada, E. A dual signaling cascade that regulates the ectodomain shedding of HB-EGF
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 276 ??? 30475-30482 2001

全著者名 論文名
Hirata, M., Umata, T., Takahashi, T., Ohnuma, M., Miura, Y., Iwamoto R. and Mekada, E. Identification of serum factor inducing ectodomain shedding of proHB-EGF and studies of non-cleavable mutants of proHB-EGF
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Biochem. Biophys. Res. Commun. 282 ??? 915-922 2001

全著者名 論文名
Kusukawa, J., Ryu, F., Kameyama, T., Mekada, E. Reduced expression of CD9 in oral squamous cell carcinoma: CD9 expression inversely related to high prevalence of lymph node metastasis
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Oral Pathol. Med. 30 ??? 73-79 2001

全著者名 論文名
Takahashi, T., Umata, T. and Mekada, E. Extension of juxtamembrane domain of diphtheria toxin receptor arrests translocation of diphtheria toxin fragment A into cytosol
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Biochem. Biophys. Res. Commun. 281 ??? 690-696 2001

全著者名 論文名
Nakamura, Y., Handa, K., Iwamoto, R., Tsukamoto, T., Takahashi, M. and Mekada, E. Immunohistochemical distribution of CD9, heparin binding epidermal growth factor-like growth factor and integrin a3b1 in normal human tissues
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Histochem. Cytochem. 49 ??? 439-444 2001

全著者名 論文名
Baba, I., Shirasawa, S., Iwamoto, R., Okumura, K., Tsunoda, T., Nishioka, M., Fukuyama, K., Yamamoto, K., Mekada, E. and Sasazuki, T. Involvement of deregulated epiregulin expression in tumorigenesis in vivo through activated Ki-Ras signaling pathway in human colon cancer cells.
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Cancer Res. 60 ??? 6886-6889 2000

全著者名 論文名
Ryu, F., Takahashi, T., Nakamura, K., Takahashi, Y., Kobayashi, T., Shida, S., Kameyama, T. and Mekada, E. Domain analysis of the tetraspanins: studies of CD9/CD63 chimeric molecules on subcellular localization and upregulation activity for diphtheria toxin binding
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Cell Struct. Funct. 25 ??? 317-327 2000

全著者名 論文名
Suzuki, H., Okazawa, Y., Komiya, T., Saeki, K., Mekada, E., Kitada, S., Ito, A. and Mihara, K. Characterization of Rat Tom40, a central component of the preprotein yranslocase of the mitochondrial outer membrane
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 275 ??? 37930-37936 2000

全著者名 論文名
Saeki, K., Suzuki, H., Tsuneoka, M., Maeda, M., Iwamoto, R., Hasuwa, H., Shida, S., Takahashi, T., Sakaguchi, M., Endo, T., Miura, Y., Mekada, E. and Mihara, K. Identification of mammalian Tom22 as a subunit of the preprotein translocase of the mitochondrial outer membrane
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 275 ??? 31996-32002 2000

全著者名 論文名
Doh-ura, K., Mekada, E. and Iwaki, T. Enhanced CD9 expression in the human and mouse brains infected with transmissible spongiform encephalopathies
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Neuropathol. Exp. Neurol. 59 ??? 774-785 2000

全著者名 論文名
Nakamura, K., Mitamura, T., Takahashi, T., Kobayashi, T. and Mekada, E. Importance of the Major Extracellular Domain of CD9 and the EGF-like Domain of HB-EGF for Upregulation of Binding and Activity
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 275 ??? 18284-18290 2000

全著者名 論文名
Yu, X., Miyamoto, S. and Mekada, E. Integrin-dependent EGF Receptor Activation at cell-cell Contact Sites
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Cell Sci. 113 ??? 2139-2147 2000

全著者名 論文名
Tsuneoka, M. and Mekada, E. Ras/MEK signaling suppresses Myc-dependent apoptosis in cells transformed by c-myc and activated ras
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Oncogene 19 ??? 115-123 2000

全著者名 論文名
Miyado, K., Yamada, G., Yamada, S., Hasuwa, H., Nakamura, Y., Ryu, F., Suzuki, K., Kosai, K., Inoue, K., Ogura, A., Okabe, M. and Mekada, E. Requirement of CD9 on the egg plasma membrane for fertilization
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Science 287 ??? 321-324 2000

全著者名 論文名
Iwamoto, R. and Mekada E. Heparin-binding EGF-like growth factor: a juxtacrine growth factor
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Cytokine & Growth Factor Reviews 11 ??? 335-344 2000

全著者名 論文名
Iwamoto, R., Handa, K. and Mekada, E. Contact-dependent Growth Inhibition and Apoptosis of EGF Receptor-expressing Cells by the Membrane-anchored Form of Heparin-binding EGF-like Growth Factor.
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 274 ??? 25906-25912 1999

全著者名 論文名
Izumi, Y., Hirata, M., Hasuwa, H., Iwamoto, R., Umata, T., Miyado, K., Tamai, Y., Kurisaki, T., Sehara-Fujisawa, A., Ohno, S. and Mekada, E. A metalloprotease-disintegrin, MDC9/Meltrin-γ/ADAM9, and PKCδ are involved in TPA-induced ectodomain shedding of membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
EMBO J. 17 ??? 7260-7272 1998

全著者名 論文名
Tsuneoka, M. and Mekada, E. N-myc transactivates RCC1 gene expression in rat fibroblast cells transformed by N-myc and v-ras.
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biochem. 124 ??? 1013-1019 1998

全著者名 論文名
Umata, T. and Mekada, E. Diphtheria toxin translocation across endosome membrane. A novel cell permeabilization assay reveals new diphtheria toxin fragments in endocytic vesicles.
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 273 ??? 8351-8359 1998

全著者名 論文名
Mitamura, T., Umata, T., Nakano, F., Shishido, Y., Toyoda, T., Itai, A., Kimura, H. and Mekada, E. Structure-function analysis of the diphtheria toxin receptor toxin binding site by site-directed mutagenesis
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Biol. Chem. 272 ??? 27084-27090 1997

全著者名 論文名
Kagawa, T., Mekada, E., Shishido, Y. and Ikenaka K. Immune system-related CD9 is expressed in mouse CNS myelin at very late stage of myelination
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
J. Neurosci. Res. 50 ??? 312-320 1997

全著者名 論文名
Tsuneoka, M., Nakano, F., Ohgusu, H. and Mekada, E. c-myc activates RCC1 gene expression through E-box elements
学術雑誌名 巻 号 ページ 発行年
Oncogene 14 ??? 2301-2311 1997

C.著書（Books）
全著者名 書名
Umata, T., Sharma, K.D. and Mekada E. Diphtheria toxin and the diphtheria-toxin receptor in "Handbook of Experimental Pharmacology"ed
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
By Aktories K. and Just I. Springer-Verlag, Ber ??? p.45-66. 2000

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