平成13年度日本学術振興会未来開拓学術研究推進事業研究成果報告書概要



研究推進分野名 生命科学と化学的手法の融合による新有用物質生産
 
研究プロジェクト名 新機能人工核酸の化学的創出
 
(英文名) Chemical Approach to Creation of Artificial Nucleic Acids Having New Functions
 
研究期間 平成9年度 〜 平成13年度

プロジェクト・リーダー名 研究経費 450,924千円
氏名・所属研究機関
所属部局・職名
関根光雄 ・東京工業大学 ・大学院生命理工学研究科 ・教授 内訳 平成9年度78,344千円
平成10年度74,804千円
平成11年度85,916千円
平成12年度91,930千円
平成13年度119,930千円

1.研究組織

氏名 所属機関・部局・職 研究プロジェクトでの役割分担
松田 彰 北海道大学・大学院薬学研究科・教授 新機能RNAアプタマーの産出
小宮山 真 東京大学・先端科学技術センター・教授 核酸切断機能を有する人工酵素の開発
菊池 洋 豊橋技術科学大学・工学部・教授 標的遺伝子制御物質の産出
長谷川典巳 山形大学・理学部・教授 分子認識を基盤とする新機能核酸の産出
早川 芳宏 名古屋大学・大学院人間情報学研究科・教授 核酸結合性物質の効率的合成
牧野 圭祐 京都大学・国際融合創造センター・教授 機能構造をもつ人工核酸の化学的創出
杉本 直己 甲南大学・理学部・教授 人工機能核酸の高次元構造の予測と機能増強
和田 猛 東京大学・大学院新領域創成科学研究科・助教授 新機能人工核酸の化学的創出

2.研究計画の概要

 本研究プロジェクトでは、天然に存在する様々な機能性生体分子からヒントを得て、生命科学諸分野の研究の質的改革をもたらし飛躍的な基礎・応用研究が展開できる種々の有用な新規人工核酸分子の創出を目指し研究を展開する。このような新機能人工核酸を創生するために本プロジェクトでは、有機化学、生化学、農芸化学、物理化学、酵素化学の諸分野にまたがる融合した合成技術を駆使してその実現を図る。
 本研究プロジェクトでは、まず新しい人工機能核酸の創出のための基盤合成技術となるDNAの革新的化学合成技術の開発を行う。この研究と同時に塩基部位無保護法によるDNAの化学合成法を開発し、従来合成困難であった2ーアジドデオキシアデノシンや4−チオウリジンや6−チオグアノシンを含む核酸を合成する。また、光クロスリンク能をもつDNAやRNAに組み込む一般的方法を同時に開発する。アミノアシルシンセターゼの結晶構造解析に有用なアミノアシルアデニレートアナログを創出する。RNAの3’末端のビオチン標識剤を開発し、核内局在性低分子RNAである特異な超メチル化されたキャップ構造をもつU1snRNAのフラグメントを化学合成し、キャップ構造に特異的に結合するタンパクの単離同定をおこなう。ベント核酸の構造モチーフを構築し、新機能人工核酸に組み込み特異なベント特性を機能発現に積極的に活用する。糖類をはじめとする生体物質を認識するRNAアプタマーの創出を図る。複核錯体を用いる人工制限酵素機能をもつDNAを創出する。3重らせん形成に基づく、ペンタエリスリトールの一個の水酸基にインターカレーターを導入した熱的安定性なアンチセンスDNAを創出する。このような研究計画のもとで、9名の研究グループの情報交流を保ち、有機的連携を活かして研究を実施する。

3.研究目的
1)新しい人工機能核酸の創出のための基盤合成技術となるDNAやRNAの革新的化学合成技術の開発を行う。
2)現状では合成困難な天然及び非天然修飾塩基を含む種々の核酸の大量供給が可能になる基本的なテクノロジーを確立する。
3)核膜透過機能をもつキャップ構造を付加させたRNAとそのDNA誘導体を創出する。従来非常に困難であったU1RNAに特異的に結合するタンパクの単離同定をおこなう。
4)DNA/RNAを高選択的に切断できる人工核酸ヌクレアーゼを創出する。
5)強力なハイブリダイゼーション能をもつ遺伝子制御物質としてのアンチセンス核酸を創出する。
6)抗体を得ることが困難なオリゴ糖に対するRNAアプタマー、プロテアーゼのRNA阻害剤を創出する。
7)アミノアシルシンセターゼの結晶構造解析に有用なアミノアシルアデニレートアナログを創出する。
8)立体選択的なホスホロチオエート型修飾DNAの大量合成を確立する。
9)3重らせん形成に基づく、DNAの発現制御機能をもつ人工核酸を創出する。
10)RNA切断機能をもつ人工DNA酵素を創出する。

4.研究成果の概要
4−1 研究計画、目的に対する成果
研究目的の欄の項目に従って研究成果を述べる
1)プロジェクトリーダーはH-ホスホネート法による塩基部無保護DNAの化学合成法をいち早く開発し、さらにプロトンブロック法による斬新なDNA化学合成法を開発し、最終年度においてはHOBT法と呼ばれる塩基部位無保護でもほぼ100%選択的な縮合反応を実現した画期的で、現在最も進化したDNA化学合成法を開発することができた。この研究成果は学術的に最高峰のものである。
2)H-ホスホネート法による塩基部無保護DNAの化学合成法によって、これまで困難であった光クロスリンク能をもつアジド基をもつDNAの合成を達成した。
3)超メチル化されたキャップ構造をもつU1snRNAのフラグメントを固相合成で、一挙に合成に成功し、さらに、この分子に結合するタンパク質を世界に先駆けて単離同定することができた。また、この分子の核内移行の機構を明確に解明することができた。
4)二核の複核錯体をDNAに導入することによって高選択的にRNAを切断できる人工核酸を開発した。
5)2量体レベルで立体を完全に固定したUpU直鎖状構造モチーフをRNAに組み込むことによって、これまで類例がない強力に標的RNAやDNAに結合できるアンチセンス核酸を創出することができた。また、2−チオウリジン誘導体をRNAに組み込むことによって、正確にアデニン塩基とのみ塩基対形成できる超高精度遺伝子診断技術を確立し、従来深刻であった誤診の問題を解決した。
6)3名の班員がこのテーマに参画したが、糖を認識するRNAアプタマアーは弱く結合すると思われるものしか得られていない。スタートのポピュレーションが小さいためと思われる。しかし、サチライシン阻害剤となるRNAアプタマーを開発できた。細胞表層成分に対するものは今後期待できる成果が得られた。
7)最も合理的なアミノアシルアデニレートアナログを合成することができた。
8)新しい活性化剤を用いることで、完全に立体選択的にホスホロチオエート型修飾DNAの合成法を開発できた。
9)DNA二重らせんに配列特異的に結合できるペンタエリスリトールを用いる3’ー3’連結型のアンチセンスDNAオリゴマーを創出できた。
10)亜鉛複核錯体を組み込んだ人工DNAを用いて効率良く位置選択的にRNAを加水分解することに成功した。また、中性条件では加水分解しにくいDNAをCe(IV)にポリビニルピロリドン、デキストラン、EDTA、スペルミンを添加すると飛躍的に加水分解されることを見いだした。

4−2 研究計画、目的外の成果
 目的外の研究成果も数多く得ることができた。アミノアシルアデニレートのアナログ合成に関連して、この基本構造とよく似た天然物である抗生物質として知られていたP-N結合をもつホスミドシンも合成することができた。驚いたことに、この化合物は幅広く種々の固形がんに強い抗腫瘍活性を示した。また、p53に非依存的なユニークな抗がん活性をもつことも見いだした。この研究に関連して、核酸系抗生物質の中で最も合成困難であった抗植物腫瘍活性をもちP-N結合を2個もつAgrocin84の全合成も達成することができた。これまで、核酸の化学合成で用いられていたアシル基型保護基で保護されたシトシン塩基は保護基を脱保護しなくとも相補的アデニン塩基と塩基対形成ができることを見いだした。この知見はこれまで、保護基の概念を覆す研究結果であり、保護基をもったままの人工核酸が塩基対形成能をもつことを初めて示すことができた。この保護基をもったDNAを逆に効率良く化学合成するために固相合成において重要な中性条件で脱離できるシランジイル系の新しいリンカーも開発することができた。これらの開発の結果、種々の塩基性で不安定な機能性官能基をもつDNA誘導体を得る基本的なルートを開拓できた。ベント構造モチーフをもつ人工核酸を合成している際、思い掛けなく極めて立体が固定できたUターン構造を再現した構造モチーフも得ることができた。これらの構造モチーフは今後遺伝子診断のための強力な武器として活用できると期待できる。

4−3 研究成果の展望
 まず、第一に、塩基部位無保護DNAの化学合成の研究は世界でトップを走る研究成果を得ることができた。アミノ基を保護しないで選択的に糖水酸基にだけ縮合反応を100%実現したことは極めて大きな成果である。これまで、DNAの化学合成は40年の歴史があるが、これまでの常識を完全に覆した価値ある研究成果である。これと、逆の発想から生まれた保護基をもつ核酸が塩基対形成能をもつことを明らかにした研究も評価が極めて高い。今後、この知見は多くの研究者で活用されるインパクトの高いものである。さらに、2-チオウラシル塩基が極めて正確にアデニン塩基と塩基対形成をすることを見いだしたことは、今後アンチセンス核酸のすべてのチミン塩基を2-チオウラシル塩基に置き換える時代がくるものと思われる。その位重要な研究結果であった。また、最終年度に見いだしたトリチルチオ基の性質を活用した中性条件でかつ、ホスファイト中間体の酸化と5’保護基の同時脱保護を可能にした研究は、今後DNAチップ上で簡便にDNA鎖を伸長していく反応操作として、極めて簡便であり短工程で済むために、産業界で利用されると期待される。一方、DNAのインターヌクレオチド結合のミミックとして今回開発したスクアリン酸ジアミド結合を利用する化学は将来もっと立体環境を考慮することで標的mRNAやDNAとさらに強く結合させる分子設計も可能であり、今後の展開が期待される。超メチル化されたキャップ構造もつU1snRNAの5’末端の固相合成は固相で一挙に単離精製することなく、最後まで合成をすることができる極めて簡便な合成法であった。このような中性条件でも不安定性を示すキャップ構造のような官能基をもつ複雑な核酸分子もこの方法で合成できることを示唆するものであり、今後はこの合成法を基本とする様々なDNA,RNAの合成が期待される。とくに、超メチル化されたキャップ構造をもDNA分子は核内に選択的に移行できるものと予想されるので、本プロジェクト研究で得られた知見を最大限に活用することによって優れた研究に発展できることが大いに期待できる。

4−4 本事業の趣旨に鑑み、果たした役割
 本研究プロジェクトはいくつかの新しいコンセプトに基づいて有用物質を数多く産出することができた。ひとつは”塩基部無保護”によるDNA合成法を徹底的に追及することによって、全く新しい可能性を将来に生み出した。すなわち、塩基部位に保護基がないということは保護基を脱保護しないでいいことを意味する。したがって、たとえば、DNAチップ上で無保護DNA合成を実施すると縮合反応のみをおこなうだけで、目的の修飾塩基を含むDNAを直接合成することができる。このような合成法が可能となることは次世代のDNAチップをつくりあげる基礎研究として本研究プロジェクトを位置づけることができよう。未来開拓という意味では、また、ベント核酸の構造モチーフは今後さまざまな領域で応用できるものであり、まさに未来に役に立つ新しい素材である。アミノアシルアデニレートのアナログ合成で偶然に見いだした抗がん活性は、今後医薬品開発にひとつの指標を与えるものである。ホスミドシンの構造から、リード化合物として様々な修飾が考えられる。近未来にはさらに優れた抗がん活性をデザインすることができる可能性を秘めている。本研究プロジェクトでは有機化学を中心として、分子生物学とのコンタクトによる超メチル化キャップ構造を認識でき結合できるタンパクであるSnurporti 1の発見に到達できた。これは国際共同研究によって初めて可能であったものであり、その意義は極めて大きい。この共同研究の成果は次の段階の研究として、超メチル化キャップ構造を有効利用する新しいアンチセンス法への開発に道はつながっている。将来、キャップ構造のメチル基の違いだけで、核と細胞質にそれぞれ選択的にDNAやRNAを局在化する技術への発展にも直結するものである。本プロジェクト研究では、様々な分野の研究者を集め組織化することによって、最新の情報交換が可能となり、いくつか共同研究も実行され、成功をおさめてきた。この意味で異分野間の研究交流の活性化に本研究プロジェクトは大いに役にたった。今後は、益々このような研究グループの効率よい研究が進展するものと確信している。

5.キーワード

(1)DNAの革新的化学合成法、(2)N-アシルDNA 、(3)U1snRNAの核膜透過機構
(4)超メチル化キャップ構造、(5)ベント構造の立体固定、(6)直鎖状構造の立体固定
(7)2−チオウリジン、(8)遺伝子診断、(9)アンチセンス法

6.研究成果発表状況

A.学術雑誌論文(Journal Papers)
全著者名 論文名
Akio Kobori, Kenichi Miyata, Masatoshi Ushioda, Kohji Seio and Mitsuo Sekine A New Method for the Synthesis of Oligodeoxynucleotides Containing 4-N-Alkoxycarbonyldeoxycytidine Derivatives and Their Hybridization Property
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Org. Chem. 67 2 476-485 2002

全著者名 論文名
Hiroshi Matsuo, Tomohisa Moriguchi, Toshimitsu Takagi, Takahiro Kusakabe, Stephen Buratowski, Mitsuo Sekine, Yoshimasa Kyogoku, and Gerhard Wagner,Efficient Synthesis of 13C, 15N-Labeled RNA Containing the Cap Structure m7GpppA
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Am. Chem. Soc. 122 11 2417-2421 2000

全著者名 論文名
Mitsuo Sekine, Osamu Kurasawa, Koh-ichiroh Shohda, Kohji Seio, and Takeshi Wada Synthesis and Properties of Oligodeoxynucleotides Incorporating a Conformationally Ridid uridine Unit having a Cyclic Structure at the 5'-Terminal Site
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Org. Chm. 65 12 3571-3578 2000

全著者名 論文名
Hiroyuki Tsuruoka, Koh-ichiroh Shohda, Takeshi Wada, Mitsuo Sekine,Synthesis and Conformational Properties of Oligonucleotides Incorporating 2'-O-phosphorylated Ribonucleotide as Structural Motifs of Pre-tRNA Splicing Intermediates
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Org. Chem. 65 22 7479-7494 2000

全著者名 論文名
M. Kadokura, T. Wada, K. Seio, M. Sekine Synthesis of 4-Thiouridine, 6-Thioinosine and 6-Thioguanosine 3',5'-O-Bisphosphates as Donor Molecules for RNA Ligation and Their Application to the Synthesis of Photoactivatable TMG-Capped U1 RNA Fragments
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Org. Chem. 65 17 5104-5113 2000

全著者名 論文名
Mitsuo Sekine, Osamu Kurasawa, Koh-ichiroh Shohda, Khoji Seio, and Takeshi Wada Synthesis and Properties of Oligonucleotides Having a Phosphorus Chiral Center by Incorporation of Conformationally Rigid 5'-Cyclouridylic Acid Derivatives
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Org. Chem. 65 20 6515-6524 2000

全著者名 論文名
Tomohisa Moriguchi, Terukazu Yanagi, Masao Kunimori, Takeshi Wada and Mitsuo Sekine Synthesis and Properties of Aminoacylamido-AMP: Chemical Optimization for the Construction of an N-Acyl Phosphoramidate Linkage
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Org. Chem. 65 24 8229-8238 2000

全著者名 論文名
J. Huber, U. Cronshagen, M. Kadokura, C. Marshallsay,T. Wada, M. Sekine, and R. Luhrmann ,Snurportin 1, an m3G-cap-specific nuclear import receptor with a novel domain structure
学術雑誌名 ページ 発行年
EMBO J, 17 14 4114-4126 1998

全著者名 論文名
T. Wada, Y. Sato, F. Honda, S. Kawahara, and M. Sekine Chemical Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides Using N-Unprotected H-Phosphonate Monomers and Carbonium and Phosphonium Condensing Reagents: O-Selective Phosphonylation and Condensation
学術雑誌名 ページ 発行年
J. Am. Chem. Soc. 119 50 12710-12721 1997

B.国際会議発表論文(International Conferences)
全著者名 論文名
Mitsuo Sekine, Michinori Kadokura, Takahiko Satoh, Takeshi Wada, and Kohji Seio The Chemical Synthesis of Hypermethylated Capped RNA on Polymer Supports(Invited)
会議名 開催場所 論文番号 ページ 発行年
The IX International Symposium on Fine Chemistry and Functional Polymers Haikou, P. R. China FP-82 318 1999

C.著書(Books)
全著者名 書名
Mitsuo Sekine N-Glycosylation in Glycoscience-Chemistry and Chemical biology I.(Editors: B. Fraser-Reid, K, Tatsuta, J. Thiem)
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
Springer Berlin ISBN3-540-67765-8 673-690 2001

全著者名 書名
関根光雄 基礎生化学実験法第4巻核酸・遺伝子実験I 基礎編(日本生化学会編)
出版者名 出版場所 ISBN番号 ページ 発行年
東京化学同人 東京 ISBN4-8079-1183-X 198-211 2000


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